急性T淋巴细胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)是一种恶性程度高、预后差的淋巴系统恶性克隆性疾病。近年来随着大剂量联合化疗方案的应用，T-ALL的预后有了较大改善，但仍有部分T-ALL患者对标准治疗耐药，出现难治或复发，5年无病生存率仅为28-39％。在急性白血病中，mTOR(mammalian target ofrapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)信号通路的异常激活不仅参与白血病细胞的增殖、存活、细胞周期进程和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，而且可能与白血病对化疗药物的耐药性相关。现已提出以TOR信号通路的关键分子为靶点的肿瘤治疗策略，雷帕霉素(Rapamycin)作为mTOR的靶向抑制剂对恶性血液系统肿瘤有着广泛的治疗前景。近年来国内外研究发现雷帕霉素对于多种实体肿瘤如前列腺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、乳癌等，均有显著的抗癌作用。而对血液系统肿瘤尤其是T-ALL的作用则鲜有报道。因此本研究以人T-ALL细胞株(Jurkat、Molt-4)和原代细胞为实验对象，旨在探索mTOR抑制剂雷帕霉素对T-ALL细胞的作用及机理，为雷帕霉素在T-ALL中的临床应用提供实验依据。本研究共分为三个部分：第一部分雷帕霉素对急性T淋巴细胞白血病细胞的生长抑制作用本部分研究首先采用MTT比色法分析雷帕霉素对T-ALL细胞株Jurkat、Molt-4和原代细胞增殖的影响。结果显示：浓度为0．1nmol／L-100nmol／L的雷帕霉素对Jurkat、Molt-4细胞和原代T-ALL细胞具有生长抑制作用，且其抑制作用呈现时间浓度依赖效应。雷帕霉素作用Jurkat细胞、Molt-4细胞和原代T-ALL细胞72h的半数抑制浓度(50％inhibition concentration，IC50)分别为16nmol／L、23nmol／L、16nmol／L；而作用于人正常骨髓单个核细胞72h的IC50为461nmol／L，已经远大于雷帕霉素的临床允许血药浓度。为探讨雷帕霉素抑制T-ALL细胞生长的作用机制，我们从细胞凋亡、自噬两个方面做了进一步的研究。以Jurkat细胞为研究对象，采用DNA片段化分析和PARP活性检测，并结合AnnexinV染色流式细胞仪分析技术，对细胞凋亡现象进行定性或定量检测。结果显示：100nmol／L的雷帕霉素作用Jurkat细胞72小时，未出现DNA梯形条带，且无PARP激活带。1nmol／L、10nmol／L、100nmol／L的雷帕霉素作用于Jurkat细胞72小时，AnnexinV阳性的凋亡细胞百分数分别为5．33±1．33％，5．78±2．26％，5．69±2．20，与空白对照组5．37±2．19％相仿(p＞0．05)，表明雷帕霉素不能诱导Jurkat细胞凋亡。除凋亡外，自噬被认为是另一种不同于凋亡的程序性细胞死亡方式。我们采用透射电镜观察，可见经100nmol／L雷帕霉素处理72h的Jurkat细胞胞质内有大量自噬体和自噬溶酶体。结合吖啶橙染色流式细胞仪定量检测，发现Jurkat细胞经100nmol／L雷帕霉素作用72h后，自噬细胞比例为44．56±13．79％，较空白对照组(2．55±1．50％)明显升高(p＜0．05)。自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)可以显著抑制100nmol／L雷帕霉素诱导的自噬，而不增加凋亡细胞的比例。经RT-PCR和Westemblot检测不同浓度雷帕霉素处理72h后Beclin1的mRNA和蛋白表达，发现此经典自噬相关蛋白的表达显著上升，呈剂量依赖性。第二部分雷帕霉素对急性T淋巴细胞白血病细胞的mTOR信号通路、细胞周期及端粒酶活性的影响本部分首先明确了原代T-ALL细胞和细胞株均存在mTOR信号通路的激活。10nmol／L雷帕霉素作用Jurkat细胞12h后即可见mTOR下游蛋白P70S6K和S6的磷酸化受抑制。随着时间的延长，磷酸化蛋白p-S6、p-P70S6K的表达逐渐减少而总S6、总P70S6K基本不变。对于mTOR的上游蛋白Akt，雷帕霉素同样能降低其磷酸化水平。已知mTOR信号通路参与细胞周期的调控，因而我们研究了mTOR抑制剂雷帕霉素对T-ALL细胞周期的影响。采用PI染色流式细胞仪检测发现，100nmol／L雷帕霉素作用Jurkat和Molt-4细胞，16h后可见G1期细胞比例明显上升，而S期比例下降。采用血清饥饿法同步化处理Jurkat细胞，再通过血清释放刺激细胞进入S期，S期和Gl期细胞比例分别为40．3％、39．1％，而经lnmol／L、10nmol／L、100nmol／L的雷帕霉素处理24h后，S期比例分别为38．6％、19．9％、17．5％，G1期比例则分别为41．2％、64．3％、66．4％，说明雷帕霉素能显著阻断血清诱导的细胞周期从G1期到S期的转化。为进一步探讨雷帕霉素诱导的G1期阻滞的机制，我们用Westem blot检测了细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D2、Cyclin D3、P21waf1、P27kip1、c-Myc的表达变化。发现随着雷帕霉素作用时间的延长，Jurkat细胞中P21waf1和P27kip1有上调的趋势，而Cyclin D3表达逐渐减少。雷帕霉素对Cyclin D2、CDK4、CDK6均无明显影响，但能呈浓度依赖性地抑制c-Myc蛋白表达。另一方面，我们研究了雷帕霉素对Jurkat细胞的端粒酶活性的影响。TRAP法检测提示雷帕霉素作用24h后，端粒酶活性开始下降，且其抑制作用呈现浓度和时间依赖性。其次，用半定量RT-PCR检测了不同浓度的雷帕霉素作用48h对hTERT的mRNA表达的影响，显示随着药物浓度的增加，hTERT的转录逐渐减少。同时，Westernblot法检测hTERT的蛋白含量，发现雷帕霉素能下调其蛋白含量，变化趋势与hTERTmRNA表达相一致。第三部分雷帕霉素联合去甲氧柔红霉素的抗白血病作用蒽环类抗生素参与构成T-ALL的联合化疗方案，本部分主要探讨蒽环类代表药物去甲氧柔红霉素(idarubicin，IDA)联合雷帕霉素的抗白血病效应及机理。首先采用MTT法检测发现IDA作用Jurkat细胞和Molt-4细胞48h的IC50分别为21．8nmol／L和2．21nmol／L。当IDA联合10nmol／L雷帕霉素作用Jurkat细胞和Molt-4时，IDA的IC50分别降为2．95nmol／L和1．28nmol／L。联合指数小于1，说明两药的联用具有协同作用。利用电镜形态学观察和Annexin染色流式细胞仪检测发现，雷帕霉素能明显增强IDA的诱导凋亡作用。低浓度IDA单药处理Jurkat细胞和Molt-4细胞48h，凋亡细胞比例分别为17．51±3．20％和22．78±3．54％，两药联用使凋亡细胞比例分别增加为50．17±5．19％和47．33±9．03％(p＜0．05)。同样，两药联用组较IDA单用组更显著地激活了Caspase3和底物PARP，而caspase8和caspase9在两药联用组均呈现出最明显的激活，说明两药联用后是通过细胞膜和线粒体双途径影响细胞凋亡的。为进一步研究凋亡的线粒体途径，我们采用Westem分析了启动线粒体凋亡途径的重要蛋白Bax、Bcl-2、Survivin，发现雷帕霉素能逆转IDA引起的Bcl-2的上调，且两药联用组的Bax／Bcl-2比值较两药单用组明显显著升高。对于Survivin，两药联用较两药单用对Survivin下调无明显增强作用。此外，IDA能使mTOR信号通路上的Akt、P85S6K和P70S6K发生磷酸化激活，联用雷帕霉素后能使P85S6K、P70S6K和Akt磷酸化水平明显降低。单用IDA或单用雷帕霉素对ERK的磷酸化均无明显影响，但两药一旦联用，则能协同下调ERK的磷酸化水平。说明两药联用能通过抑制Akt／mTOR、ERK信号通路而发挥抗T-ALL作用。综上所述，本研究得出以下结论：(1)雷帕霉素可直接抑制T-ALL细胞的生长，具有剂量时间依赖性。(2)单用雷帕霉素并不能引起细胞凋亡，但可诱导自噬，并伴有自噬相关蛋白Beclinl的表达增加。3-MA阻断自噬不能促使向凋亡转化。(3)雷帕霉素对mTOR上游Akt和下游P70S6K、S6的磷酸化均有抑制作用。(4)雷帕霉素可使T-ALL细胞周期受阻于G1期，并下调Cyclin D3和c-Myc，上调P21waf1、P27kip1的表达。(5)雷帕霉素能够抑制细胞端粒酶活性，并下调hTERT的mRNA及蛋白表达水平。(6)雷帕霉素和IDA对T-ALL细胞的生长抑制具有协同作用。两药联用时能通过线粒体和细胞膜双途径增强凋亡效应，且通过调控Bax、Bcl-2、Survivin等影响线粒体途径的调亡。(7)雷帕霉素能逆转IDA引起的Bcl-2的上调和Akt／mTOR信号通路的激活，抑制ERK信号的活化，为临床上两药的联用提供实验证据。