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群体感应(Quorum Sensing,QS)是细菌自诱导分子(AI)介导的信号系统。是细菌之间特定的交流方式,即细菌产生信号分子,并将信号分子释放到环境中去,当这些分子的浓度达到与高细胞密度或群体相一致的临界值时,该细菌群体便开始一些特定基因的协调表达,从而使细菌在群体规模上展现出新的行为特征,如生物发光功能、毒力因子的分泌调控、芽孢的形成或生物被膜的形成。关于群体感应系统,以前的研究集中在细菌分泌的信号分子对自身或其他种类细菌的调控,本研究则进一步瞄准在细菌群体信号分子对宿主细胞的影响。旨在通过研究细菌群体感应信号分子3OC12-HSL对宿主细胞的直接作用,进一步揭示群体感应系统在细菌与宿主细胞互作中的功能。本研究选用仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2作为模型细胞进行了如下研究:1.基于RNA-Seq筛选细菌群体感应信号分子30C12-HSL刺激仔猪小肠上皮细胞差异表达基因细菌通过群体感应信号分子的合成与吸收,在种群规模进行特定交流,从而调控多种生物学功能;为进一步探寻细菌群体感应信号分子是否不仅作用于细菌,而对宿主真核细胞同样存在直接刺激功能,本研究选用仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2,采用终浓度为100μM的 Autoinducer-2(AI-2)、N-Hexanoyl-Homoserine Lactone(C6-HSL),和 N-3-oxododecanoyl homoserine lactone(30C12-HSL)三种来源于不同细菌的重要群体感应信号分子对细胞进行刺激,并以高通量RNA-Seq技术筛选肠道细胞经细菌群体感应分子刺激后的差异表达基因;AI-2组上调1个、下调7个基因;C6-HSL组上调2个、下调8个基因;30C12-HSL组上调20个、下调15个基因。30C12-HSL组差异表达基因数最多,故后续分析集中在30C12-HSL组展开。对差异表达基因进行生物信息学GO功能分类和KEGG信号通路分析,30C12-HSL组的GO功能分类结果显示,这些基因主要涉及到免疫系统、结构分子活性及细胞连接等功能;KEGG分析表明这些差异表达基因参与细胞骨架、致病性大肠杆菌感染、细胞粘附分子(CAM)、细胞外基质外受体的相互作用等信号通路。选择8个差异表达基因(其中7个与细胞骨架/细胞连接相关)进行荧光定量PCR验证,各基因的表达变化趋势与转录组学测序结果一致。本研究为进一步研究细菌群体感应分子在病原菌与宿主互作、直接刺激宿主肠道细胞的作用及其相关机制研究奠定了基础。2.细菌群体感应分子30C12-HSL对仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2的影响肠道上皮细胞间通过细胞连接的交流调控细胞内稳态,并维持肠上皮细胞防御能力。群体感应系统信号分子不仅可调控细菌毒力,同时参与调控宿主细胞,协助病原菌致病机制,整个过程即跨种间信号传导(interkingdom signaling)。30C12-HSL对IPEC-J2细胞形态具有明显影响;MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)结果显示,30C12-HSL对IPEC-J2细胞活性无影响,显示细胞形态变化并非来自与信号分子毒性;利用不同浓度的30C12-HSL作用IPEC-J2不同时间,结果显示细胞形态变化与浓度及作用时间正相关;低至25μM即可引起细胞形态的明显变化,验证了细胞对与群体信号分子的敏感性;细菌黏附试验结果显示,30C12-HSL能增强肠致病性大肠杆菌对宿主细胞IPEC-J2的黏附;而细菌侵袭试验结果显示F18ab大肠杆菌对宿主细胞侵袭下降;荧光定量PCR与Western blot结果揭示紧密连接、而不是间隙连接,与群体信号刺激肠上皮细胞机制有关,紧密连接ZO-1蛋白的表达显著增加。