支链氨基酸合成途径相关基因在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的功能研究

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稻瘟病是水稻上的三大病害之一,给世界的粮食安全带来了严重威胁。由于该病原菌生理小种易变,因此稻瘟病的防治始终是目前水稻生产上的一个重要难题。稻瘟病菌作为一种模式病原茵,研究其在侵染过程各阶段重要基因的功能及致病分子机制有助于制定长期有效的稻瘟病菌防治策略。随着稻瘟病菌全基因组测序的完成,运用分子生物学手段鉴定致病相关基因已经越来越方便。其中蛋白质组学研究技术是近几年来在各个生命科学领域广泛应用的一种检测差异蛋白的方法。稻瘟病菌G蛋白在信号转导过程中起着非常重要的作用,参与调控稻瘟病菌的生长发育、孢子的产生、附着胞的形成和致病性过程。G蛋白信号途径的调控因子RGS(RegulatorsofG-proteinssignaling)是G蛋白信号途径的负调控因子。在稻瘟病菌全基因组中共鉴定到8个MoRGS基因,对这些基因进行生物学功能分析发现,MoRGS1作为Gα的负调控因子参与调控稻瘟病菌的无性繁殖、附着胞的分化、细胞壁的完整性以及致病过程;MoRGS2主要参与无性繁殖;MoRGS3和MoRGS4作为Gα的负调控因子参与调控有性/无性、产孢及致病性;MoRGS7主要参与调控稻瘟病菌的致病性;缺失MoRGS5、MoRGS6和MoRGS8对致病性没有影响。为了进一步阐明稻瘟病菌中MoRgs蛋白(MoRgs1、MoRgs2、MoRgs3、MoRgs4、MoRgs7)的调控机制,运用蛋白质组学的方法分析获得⊿Morgs突变体与野生型显著差异表达蛋白,并对感兴趣的相关蛋白作进一步的研究。本论文主要对支链氨基酸合成途径中的乙酰乳酸合成酶(ALS)和苏氨酸脱氨酶(TD)在稻瘟茵生长发育及致病过程中的功能进行了系统的研究。  双向电泳及质谱分析结果共鉴定到76个显著差异表达蛋白,这些蛋白参与到各种生理生化过程,包括氨基酸代谢、糖代谢、信号转导、遗传信息过程等方面。分析发现在⊿Morgs突变体中有9个与氨基酸合成相关的基因,其中MoILV6基因在⊿Morgs7突变体中极显著下调表达,该基因参与支链氨基酸亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)的生物合成。通过在稻瘟病菌数据库进行BlastP分析,发现一个与酵母ILV2同源的基因MoILV2,其与基因MoILV6共同编码乙酰乳酸合成酶。  乙酰乳酸合成酶是支链氨基酸合成途径中的一个关键酶,催化生成亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。研究发现在稻瘟病菌中⊿Moilv2和⊿Moilv6突变体表现亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸生长缺陷,产孢能力、附着胞侵入能力及致病性丧失。但是外源添加高浓度的三种氨基酸能恢复突变体的产孢缺陷及致病力。进一步亚细胞定位观察,MoIlv2和MoIlv6均定位线粒体行使功能,且MoIlv6的信号肽对其定位是非常关键的。  苏氨酸脱氨酶是该支链氨基酸合成途径中的第一个关键酶,该酶催化苏氨酸脱水分解生成氨和α-酮丁酸,是合成支链氨基酸异亮氨酸的关键蛋白。本文从稻瘟病菌中克隆了一个与酵母Ilv1p同源的基因MoILV1,通过同源重组的方法获得目的基因敲除突变体⊿Moilv1。对稻瘟病菌中MoILV1进行功能分析,结果表明该基因缺失突变后孢子形态发生异常,附着胞膨压降低,侵入寄主的能力下降。对其功能域进行预测并进行功能分析,结果表明PALP功能域参与稻瘟病菌产孢和致病过程,是MoIlv1行使生物学功能所必须的。  综上所述,MoRgs蛋白可能参与调控稻瘟病菌的氨基酸代谢过程;乙酰乳酸合成酶亚基MoIlv2和MoIlv6及苏氨酸脱氨酶MoIlv1参与亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的生物合成,在稻瘟病菌的生长发育、产孢和致病过程中具有非常重要的作用。
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