发酵蔬菜是蔬菜经以乳酸菌为主的复杂微生物体系(由蔬菜和辅料等带入)在相对封闭的池或坛中自然发酵而成,在世界各地都有生产和食用。发酵蔬菜中复杂的微生物体系和无二次灭菌的特点,使得发酵蔬菜极易发生腐败。在工业生产上,每年发生腐败的发酵蔬菜占总加工量的10%~20%,造成巨大的浪费和经济损失。形成腐败膜醭是发酵蔬菜腐败的典型特征之一。目前对发酵蔬菜中形成膜醭的微生物及其特性、发酵蔬菜环境对膜醭形成的影响等研究尚不深入。鉴于此,本文从发酵蔬菜腐败膜醭中分离并鉴定典型的产醭醭微生物,通过模拟培养研究其产醭特性,检测不同蔬菜模拟培养基对产醭特性的影响,分析模拟培养基中影响膜醭形成的关键因子,以及模拟培养过程中膜醭微生物产醭相关基因的表达情况。首先,产醭微生物的分离鉴定。收集发酵蔬菜腐败膜醭样品,并重悬于无菌生理盐水中。梯度稀释膜醭重悬液,涂布于胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)并过夜培养。随机挑取50个单克隆分别接种到发酵盐卤模拟培养基(TFB)中,将6株能够在培养液表面显著形成膜醭的菌株进行16S r DNA或18S r DNA分子生物学鉴定。结果表明这6株菌均为细菌,分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、科氏葡萄球菌科氏亚种(Staphylococcus cohnii subsp.cohnii)、普罗威登斯菌(Providencia vermicola)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella sp.)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。其次,建立发酵蔬菜模拟培养基体系,通过模拟培养研究产醭微生物的产醭特性。以植物乳杆菌为菌剂分别发酵6种蔬菜(黄瓜、大白菜、笋壳青菜、红皮萝卜、豇豆和二荆条),用发酵前和发酵后的发酵蔬菜制备模拟培养基共18种,用以模拟不同发酵蔬菜环境。通过凯氏定氮法、石墨炉-原子吸收分光光度仪和3,5-二硝基水杨酸比色法测定模拟培养基中氮含量、矿物质和还原糖等成分的含量。将分离得到的上述6种产醭微生物分别接种到不同模拟培养基中培养15天并分析其产醭特点。结果表明:枯草芽孢杆菌能够在4种发酵蔬菜中形成膜醭,是最容易形成膜醭的菌株;而普罗威登斯菌只能在发酵黄瓜中形成膜醭,是最不容易形成膜醭的菌株。6株产醭微生物均能在发酵黄瓜中形成膜醭,没有菌株能在发酵红皮萝卜中形成膜醭。可见,黄瓜是最易使上述微生物产膜醭的基质,而红皮萝卜则相反。利用黄瓜模拟培养基和红皮萝卜模拟培养基进一步培养枯草芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌在黄瓜模拟培养基中表现出正常生长趋势,并产生片状厚膜醭,培养液p H值上升;在红皮萝卜模拟培养基中,枯草芽孢杆菌数量由起始浓度4.0 log(CFU/m L)持续下降,不形成膜醭,培养液p H值保持不变。第三,发酵蔬菜环境对产醭相关基因表达的影响。已有大量研究表明,枯草芽孢杆菌中sin I、eps H、eps C和tas A基因的表达与其膜醭形成正相关,sin R基因则与膜醭形成呈负相关。本研究利用胰蛋白胨大豆液体培养基(TSB)和黄瓜汁(CVJ)、发酵黄瓜汁(CFVJ)、红皮萝卜汁(RSVJ)和发酵红皮萝卜汁(RSFVJ)四种模拟培养基分别培养枯草芽孢杆菌,通过荧光定量PCR技术和2-??Ct比较Ct法,以TSB为参照培养基,分析不同发酵模拟培养基对枯草芽孢杆菌产醭相关基因表达的影响。结果表明:发酵黄瓜能上调sin I、eps H、eps C和tas A表达,下调sin R表达;而发酵红皮萝卜能够下调sin I、eps H、eps C和tas A的表达,同时上调sin R的表达。综上所述,枯草芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、科氏葡萄球菌科氏亚种、普罗威登斯菌、克雷白氏杆菌属和阴沟肠杆菌等是发酵蔬菜中典型的产膜醭微生物。从细胞水平和分子水平来看,枯草芽孢杆菌是最容易形成膜醭的菌株,普罗威登斯菌是最不容易形成膜醭的菌株。发酵黄瓜最适合产醭微生物的生长并形成膜醭,而发酵红皮萝卜是最不适合产醭微生物形成膜醭。