肺动脉高压（PH）是一种病因复杂的心肺系统疾病,在海平面、静息状态下应用右心漂浮导管测得患者的肺动脉平均压力持续≥25mm Hg可诊断。PH可分为五类,其中动脉性肺动脉高压（PAH）属于第一类。目前临床主要应用靶向药物治疗PAH,靶向药物作用在一氧化氮途径,前列环素途径和内皮素途径。靶向药物的使用极大地改善了患者的症状,提高了运动耐量,延长了患者的生存时间。尽管针对PAH的治疗取得了长足的进步,但这种致命性疾病预后仍然比许多癌症差,三年生存率为68%-70%。因此,探索新的发病机制和治疗靶点有着重要的意义。PAH的病理特征主要是肺小动脉重构、肺动脉压力升高、右心室肥厚。PAH的各亚类别间具有相似的组织病理学特征,包括肺动脉内膜增生、中膜增厚、外膜胶原纤维沉积,其中最主要的是中膜肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）过度增殖导致的中膜增厚改变。近年来,有关PAH的研究主要集中在遗传转录因子、非编码RNA、炎症、氧化应激、DNA损伤、代谢紊乱、线粒体功能、干细胞等领域。长链非编码RNA（lncRNAs）是一类长度超过200nt的RNA,参与基因修饰、转录调控、转录后调控等多种生物学过程,在细胞的增殖、迁移、凋亡、表型转换等方面起到了重要的作用。LncRNAs在血管生物学稳态维持方面也发挥了重要的作用,参与了血管重构、血管收缩等过程。近年来,研究发现一些lncRNAs也参与了肺动脉高压的发生,炎症、氧化应激等因素可以调节lncRNAs的表达,并且差异表达的lncRNAs可以进一步调控PASMCs的功能表型。H19是最早发现的lncRNAs之一,主要有三种作用模式:吸附mi RNAs、募集蛋白、H19/mi R-675轴。有研究表明H19可以促进主动脉平滑肌细胞再分化,修复损伤的动脉。之前的研究报道在类风湿性关节炎中H19可以被PDGF-BB诱导上调,PDGF-BB是一种生长因子,可以刺激PASMCs增殖,导致肺小动脉重构和PAH的发生,因此我们推测H19可能参与了PAH的发生与发展。本课题组使用人外周血血浆检测发现H19在PAH病人中的表达高于对照组。通过构建野百合碱（MCT）诱导的PAH大鼠模型,发现H19在MCT诱导的PAH大鼠肺动脉和血浆中的表达水平显著高于对照组。应用细胞因子刺激PASMCs,发现H19可以被PDGF-BB诱导上调。进一步研究H19对PASMCs增殖、迁移、凋亡的影响,观察到H19可以显著促进PASMCs增殖,但是对迁移和凋亡无显著影响。通过生物信息学分析、AGO2 RIP实验、双荧光素酶报告实验等发现H19可以吸附结合Let-7b-5p和mi R-194-5p,并且发现AT₁R是Let-7b-5p和mi R-194-5p新的靶基因。通过功能回复实验发现PDGF-BB-H19-Let-7b-5p/mi R-194-5p-AT₁R轴可以通过激活ERK1/2信号通路促PASMCs增殖。利用H19敲除小鼠,在动物水平探究H19对PAH发生的影响,结果发现敲除H19可抑制MCT诱导小鼠引起的RVSP升高、肺小动脉重构、右心室肥厚。综上,我们认为H19或许可以成为PAH潜在的循环诊断标志物和潜在的治疗靶点,本研究为PAH的发病机制和诊治提供了新思路。第一部分LncRNA H19在PAH病人、MCT诱导的PAH大鼠模型、细胞因子刺激的PASMCs中的表达情况目的⑴检测lncRNA H19在PAH病人及对照组外周血血浆中的表达情况。⑵检测lncRNA H19在MCT诱导的PAH大鼠肺动脉及血浆中的表达情况。⑶检测lncRNA H19在细胞因子刺激的PASMCs中的表达情况。方法留取PAH病人外周血血浆标本,利用RT-q PCR检测H19的表达。构建MCT诱导的PAH大鼠模型,通过肺组织HE染色、RVSP测定、RVHI确认MCT诱导的PAH大鼠模型构建成功。用MCT诱导的PAH大鼠肺动脉和血浆进行RT-q PCR检测H19及细胞因子的表达。利用酶解法分离大鼠原代PASMCs,行α-SMA染色鉴定,差速贴壁法培养纯化PASMCs。细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、PDGF-AA、PDGF-BB、TNF-α、VEGF刺激PASMCs,利用RT-q PCR检测H19的表达。结果⑴H19在PAH病人血浆中的表达水平显著高于对照组。⑵H19在MCT诱导的PAH大鼠肺动脉和血浆中的表达水平显著高于对照组。⑶H19在IL-1β和PDGF-BB组的表达水平显著高于空白对照组,并且随着IL-1β和PDGF-BB浓度增加,H19表达水平逐渐升高。结论⑴H19在PAH病人外周血血浆、MCT诱导的PAH大鼠肺动脉和血浆中表达显著升高。⑵IL-1β和PDGF-BB可以诱导H19表达显著升高。第二部分LncRNA H19对PASMCs增殖、迁移、凋亡的影响目的检测lncRNA H19对大鼠PASMCs增殖、迁移、凋亡的影响。方法构建H19过表达质粒pc DNA3.1（-）-H19（pH19）和小干扰RNA si H19,阴性对照分别是pc DNA3.1（-）（Vector）和si RNA control（si Con）。将pH19和si H19转染进PASMCs,RT-q PCR检测H19的过表达和干扰效率。利用CCK-8法、流式细胞术检测H19对PASMCs增殖的影响;利用划痕实验、Transwell实验检测H19对PASMCs迁移的影响;利用流式细胞术检测H19对PASMCs凋亡的影响。结果⑴流式细胞术结果显示pH19组S+G2/M期细胞比例显著高于Vector组,CCK-8结果显示转染100ng、500ng、1000ng时,pH19组细胞增殖活性显著高于Vector组,在12h、24h、48h、72h,pH19组细胞增殖活性高于Vector组;跟si Con组相比,干扰H19可显著降低S+G2/M期细胞比例和增殖活性,PDGF-BB刺激可显著提高S+G2/M期细胞比例和增殖活性,干扰H19后部分抵消了PDGF-BB促PASMCs增殖的效应,IL-1β对细胞增殖无显著影响。⑵pH19组划痕的愈合宽度和迁移细胞数较Vector组无明显差别,si H19组划痕的愈合宽度和迁移细胞数较si Con组无明显差别。⑶pH19组细胞的凋亡比例较Vector组无明显差别,si H19组细胞的凋亡比例较si Con组无明显差别。结论⑴H19提高了PASMCs增殖活性,促使PASMCs向增殖期转变。⑵干扰H19可减弱PDGF-BB促增殖的效应。⑶H19对PASMCs迁移、凋亡无显著影响。第三部分LncRNA H19调控PASMCs增殖的作用机制研究目的探究lncRNA H19调控PASMCs增殖的作用机制。方法利用核质分离实验分别提取出细胞核、细胞质RNA,应用RT-q PCR检测H19的表达。生物信息学分析与H19结合的mi RNAs（H19-mi RNAs）,与MCT诱导的PAH大鼠肺组织mi RNAs芯片中差异表达的mi RNAs（MCT-PAH-mi RNAs）取交集。AGO2 RIP、双荧光素酶报告实验检测H19与Let-7b-5p、mi R-194-5p的相互作用。利用GO聚类分析、KEGG通路分析Let-7b-5p和mi R-194-5p共有的靶基因。生物信息学分析H19、AT₁R与Let-7b-5p、mi R-194-5p作用的结构基础。利用双荧光素酶报告实验、Western Blot、RT-q PCR检测Let-7b-5p、mi R-194-5p对AT₁R的调控。转染H19过表达质粒,利用Western Blot、RT-q PCR分析H19过表达对AT₁R及ERK1/2通路的影响。Western Blot检测抑制ERK1/2磷酸化（U0126）对Cyclin A2、CDK1、PCNA表达的影响。共转染si H19与Let-7b-5p/mi R-194-5p inhibitor进行回复实验,检测AT₁R、ERK1/2的表达及PASMCs细胞周期、增殖活性的变化。分别共转染p AT₁R与Let-7b-5p/mi R-194-5p mimic、pH19与si AT₁R/U0126进行功能回复实验,检测PASMCs细胞周期、增殖活性的变化。结果⑴核质分离实验结果发现79%的H19 RNA富集在PASMCs细胞质中,双荧光素酶报告实验结果发现Let-7b/mi R-301a/mi R-185/mi R-194-5p mimic转染组荧光素酶活性较mi Con组显著降低;AGO2 RIP实验结果表明Let-7b-5p mimic和mi R-194-5p mimic转染组H19富集度最高;双荧光素酶报告实验结果表明,共转染p GL3-H19与Let-7b-5p/mi R-194-5p mimic后,随着mimic浓度增加,荧光素酶活性逐渐下降,将结合序列敲除或突变后,荧光素酶活性无明显变化。⑵KEGG通路分析发现Let-7b-5p和mi R-194-5p共有的靶基因主要富集在肾素通路等;双荧光素酶报告实验结果显示,随着Let-7b-5p/mi R-194-5p mimic转染浓度增加,p GL3-AT₁R组荧光素酶活性逐渐下降,将结合序列突变后,荧光素酶活性无明显变化;Western Blot、RT-q PCR结果显示转染Let-7b-5p/mi R-194-5p mimic后,跟对照组相比,AT₁R m RNA和蛋白水平都显著降低;转染Let-7b-5p/mi R-194-5p inhibitor后,跟对照组相比,AT₁R m RNA和蛋白水平都显著升高。⑶Western Blot、RT-q PCR结果显示,跟Vector组比较,pH19组AT₁R、Cyclin A2、CDK1、PCNA m RNA和蛋白水平都显著升高,ERK1/2磷酸化程度显著升高,AKT磷酸化程度未见显著改变;Western Blot结果显示,跟DMSO组相比,U0126组ERK1/2磷酸化程度显著降低,并且Cyclin A2、CDK1、PCNA蛋白水平表达也显著降低。⑷回复实验结果显示,si H19可以下调AT₁R、Cyclin A2、CDK1、PCNA m RNA和蛋白水平的表达,并且显著降低ERK1/2磷酸化水平,而Let-7b-5p/mi R-194-5p inhibitor可以部分抵消这种下调效应,也可以部分抵消si H19对PASMCs增殖的抑制效应;Let-7b-5p/mi R-194-5p mimic可以抑制PASMCs增殖,p AT₁R可以部分抵消这种抑制效应;pH19可以促进PASMCs增殖,si AT₁R和U0126可以部分抵消这种促进效应。结论⑴H19可以结合Let-7b-5p和mi R-194-5p。⑵AT₁R是Let-7b-5p和mi R-194-5p新的靶基因。⑶PDGF-BB-H19-Let-7b-5p/mi R-194-5p-AT₁R轴通过激活ERK1/2信号通路促PASMCs增殖。第四部分H19在MCT诱导的PAH小鼠模型发病中的作用研究目的探究H19在MCT诱导的PAH小鼠模型发病中的作用。方法利用C57/BL6小鼠和H19敲除小鼠,构建MCT诱导的PAH小鼠模型,实验分为4组,分别为C57/BL6生理盐水对照组（WT Control）、C57/BL6野百合碱组（WT MCT）、H19敲除小鼠生理盐水对照组(H19^-/-Control)、H19敲除小鼠野百合碱组(H19^-/-MCT),每组6只小鼠。利用右心导管法测定小鼠RVSP,肺组织HE染色、α-SMA免疫组化实验测算肺小动脉重构指标:肌型动脉百分比和WT%,RVHI测算右心室重塑情况。敲除H19后,利用Western Blot、RT-q PCR检测Let-7b-5p、mi R-194-5p、AT₁R、ERK1/2信号通路的表达。结果⑴野生型小鼠经MCT诱导八周后,RVSP显著高于对照组（33.41mm Hg±2.19mm Hg vs 19.32mm Hg±0.79mm Hg,P<0.001）;H19^-/-MCT组跟H19^-/-Control相比,RVSP未见显著改变,但H19^-/-MCT组RVSP显著低于WT MCT组（17.72mm Hg±1.54mm Hg vs 33.41mm Hg±2.19mm Hg,P<0.001）。⑵WT MCT组跟WT Control组相比,WT%显著增加（40.60%±3.79%vs19.11%±2.56%,P<0.001）并且肌化型肺小动脉占比显著增加（PM:28.55%±2.65%vs 18.89%±2.66%,P<0.001;FM:41.91%±4.34%vs 17.13%±2.25%,P<0.001）;H19^-/-MCT组跟H19^-/-Control组相比,WT%和肌化型肺小动脉占比未见显著改变;H19^-/-MCT组跟WT MCT组相比,WT%显著下降（23.92%±3.17%vs40.60%±3.79%,P<0.001）并且肌化型肺小动脉占比显著降低（PM:21.74%±0.72%vs 28.55%±2.65%,P<0.01;FM:20.22%±1.80%vs 41.91%±4.34%,P<0.001）。⑶WT MCT组RVHI显著高于WT Control组（0.23±0.03 vs 0.15±0.01,P<0.001）;H19^-/-MCT组跟H19^-/-Control相比,RVHI未见显著改变;H19^-/-MCT组RVHI显著低于WT MCT组（0.17±0.02 vs 0.23±0.03,P<0.01）。⑷IL-1β、PDGF-AA、PDGF-BB、IL-6、TNF-α、VEGF在WT MCT和H19^-/-MCT小鼠肺动脉中表达升高;AT₁R和ERK1/2磷酸化水平在WT MCT小鼠肺动脉中表达升高,但在H19^-/-MCT小鼠肺动脉中未见显著改变,Let-7b-5p和mi R-194-5p在WT MCT和H19^-/-MCT小鼠肺动脉中均未见显著改变。结论⑴敲除H19可抑制MCT诱导小鼠引起的RVSP升高、肺小动脉重构、右心室肥厚。⑵H19敲除后,经MCT诱导,PDGF-BB表达升高,AT₁R、Let-7b-5p、mi R-194-5p、ERK1/2表达无显著改变。