脑胶质瘤(glioma)是世界上最致命的肿瘤之一,其预后差、死亡率高,五年生存率不足5%,被称为生命的“灾星”。由于中枢神经系统结构复杂,胶质瘤又呈浸润性生长,肿瘤组织边界不清,手术无法彻底切除肿瘤组织,使其极易复发。化学疗法在脑胶质瘤治疗中发挥重要作用,但血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的存在阻碍了超过98%的小分子药物和几乎100%的大分子药物进入脑肿瘤组织,治疗效果效果极不乐观。因此,克服BBB障碍,促进药物穿过BBB靶向脑胶质瘤病灶富集是提升疗效的关键。外泌体(Exosomes,Exos)是由多种细胞或体液分泌产生的内源性纳米级囊泡。因其免疫原性低,生物相容性好,可穿过生理病理屏障等特性,已作为新型内源性纳米递送系统,被广泛应用于脑胶质瘤、帕金森等神经系统性疾病的治疗。然而,尽管外泌体能够穿过BBB,却仍无法实现向肿瘤组织靶向递送足够浓度的治疗药物。为提升外泌体的靶向性,提高肿瘤部位的药物富集量,多数研究对其进行了化学修饰以及基因工程改造,但这些制备方法步骤复杂、耗时耗力、无法避免脱靶现象。在物理因素打开BBB方面,聚焦超声(FUS)因其非侵袭性、可逆性和瞬间局部开放BBB的特性,已被FDA批准用于脑部疾病的诊断和治疗。鉴于脑胶质瘤治疗现状的局限性以及外泌体作为载药递送系统用于脑部疾病诊疗存在的机遇和挑战,本论文开发了一种天然、安全的药物递送系统(DDS),通过联合FUS促进外泌体靶向递送阿霉素用于胶质瘤治疗。本研究比较分析了巨噬细胞来源的外泌体(R-Exos)和血液来源的外泌体(B-Exos)在该系统中的优势,旨在筛选出一个具有更好、更大的临床转化空间的递送平台。在体外,R-Exos和B-Exos均可以通过BBB,并在超声辅助下富集在胶质瘤细胞中。R-Exos和B-Exos联合FUS在物理特性、药物释放、肿瘤靶向性以及细胞毒性方面无明显差异;小动物活体成像结果显示,FUS可促进外泌体(B-Exos)在原位脑胶质瘤部位的聚集,显著抑制肿瘤生长,且无明显毒副作用。因此,Exos联合FUS有望成为一种具有应用前景的脑肿瘤治疗新策略。本论文主要从外泌体提取、表征,超声促进药物释放,体外细胞毒效应,超声促进外泌体穿过BBB和体内抗肿瘤效应评价等方面展开研究。主要从如下几个方面概述:第一部分:巨噬细胞来源外泌体和血液来源外泌体的提取和表征论文通过改良外泌体提取方法,分别从巨噬细胞和血液中分离提取外泌体,并将其作为化疗药阿霉素(Dox)的药物载体。通过优化载药方法制备得到高载药效率的Exos-Dox并进行特征鉴定。采用纳米颗粒跟踪分析系统(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)测定外泌体的粒径和电位;透射电镜观察外泌体的形貌特征;蛋白质免疫印迹法对外泌体的标志性蛋白进行鉴定。结果表明,所制备R-Exos和B-Exos在载药前后粒径大小适中,稳定性良好,电位以及标志性蛋白的表达均与相关报道相符,可作为优良药物递送载体用于后续研究。第二部分:外泌体载药效率的测定及超声促进药物释放特性研究建立阿霉素浓度与荧光值的标准曲线,根据标准曲线检测外泌体携载Dox的效率。体外药物释放规律的研究发现,在4℃、静止条件下,药物释放速率缓慢,提示外泌体具有良好的载药潜力;一定速率的流动条件于37℃模拟体内环境,外泌体本身的释药速率缓慢,但在超声辅助下药物快速释放,且随着超声强度的增加药物释放速率增快。细胞来源和血液来源的外泌体表现出相似的药物释放规律。当外泌体携载药物富集于肿瘤组织时,施以超声促进药物快速释放,以达到高效抗肿瘤效果。第三部分:R-Exos-Dox和B-Exos-Dox联合超声的细胞摄取与毒性研究通过激光共聚焦以及流式细胞仪检测GL261细胞对R-Exos-Dox和B-Exos-Dox的摄取,用MTT法检测两种外泌体对肿瘤细胞的杀伤作用。结果显示:细胞对R-Exos-Dox和B-Exos-Dox的摄取具有时间依赖性,不同种类的细胞对外泌体摄取表现出不同的趋势,肿瘤细胞相对于正常细胞而言对外泌体的摄取更多,且超声可以进一步促进肿瘤细胞对外泌体的摄取。巨噬细胞外泌体和血液外泌体自身对细胞存活率没有影响,负载Dox后,R-Exos-Dox和B-Exos-Dox对细胞的杀伤具有剂量依赖性,联合超声处理后进一步显著降低GL261细胞的存活率。第四部分:超声促进外泌体向脑胶质病灶部位的靶向递送构建体外BBB模型,探究超声是否促进外泌体穿过BBB。结果显示,外泌体本身可以穿过BBB,联合超声后极大地促进了外泌体穿过BBB的效率。利用具有完整BBB的健康小鼠为动物模型,结果亦证实超声显著促进外泌体跨越BBB并于脑部富集。建立原位脑胶质瘤模型,探究超声促进外泌体在肿瘤部位的靶向富集。结果显示,超声提高了外泌体在肿瘤部位的聚集含量,尾静脉注射外泌体后12 h其富集量达到最大,因此12 h将作为第二次超声促进药物释放的时间点。第五部分:超声联合载药外泌体对原位脑胶质瘤的抑制效应研究建立原位脑胶质瘤模型,通过小动物活体成像仪监测不同治疗后肿瘤体积变化评估抑瘤效果,同时从小鼠体重、小鼠存活期以及脏器变化等几个方面探讨研究处理模式的安全性。结果显示:处理后第15天,B-Exos-Dox联合两次超声的抑瘤效果最显著,肿瘤体积显著减小,荷瘤鼠存活期明显高于其他处理组,小鼠体重变化不明显,且各脏器的H&E染色结果提示外泌体携载Dox不会产生明显的毒副作用,说明这种处理模式具有一定的安全性。结论本研究探讨外泌体携载Dox联合超声对原位脑胶质瘤的诊疗新策略,比较和分析了巨噬细胞来源的外泌体和血液来源的的外泌体携载Dox联合超声产生的治疗效果。研究结果发现R-Exos和B-Exos均能在FUS的辅助下有效地将Dox递送到胶质瘤细胞中,显著抑制肿瘤生长且无明显毒副作用。尽管两种外泌体在物理特征、超声应答、胶质瘤靶向性等方面均无显著差异,由于血液来源的外泌体与细胞来源的外泌体相比,其来源丰富、产量高、易获得,具有更大的临床转化潜力。因此,聚焦超声联合天然丰富的B-Exos可成为有应用潜能的脑肿瘤治疗新方法。