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[研究背景与目的]原发性肝癌(PLC)是我国常见高发的恶性肿瘤,其发病率和病死率都位于全球之首；其中肝细胞癌(HCC)是最常见的类型,约占PLC的90%。由于起病隐袭,早诊困难进展较快,临床上确诊时大多数HCC已达中晚期,往往失去了手术和介入等局部治疗的机会,只能采取系统治疗作为姑息治疗,但是疗效有限,预后极差,在我国晚期HCC患者的中位生存时间仅为3-4个月,急需探索新的治疗药物和手段。榄香烯(Elemene)注射液是从传统中药莪术(Curcuma aromatica Salisbl,温郁金)中提取的萜烯类化合物,体内、体外实验表明：榄香烯注射液对于多种肿瘤细胞具有明显的抑制增殖、诱导凋亡和抗肿瘤血管生成等作用,还可以诱导肿瘤细胞产生自噬(autophagy)。甲磺酸阿帕替尼(Apatinib mesylate,简称阿帕替尼)是与Vatalanib(PTK787)类似的新型小分子酪氨酸激酶抑制剂,化学名称为N-[4-(氰基环戊基)苯基][2-[(4-吡啶甲基)氨基](3-吡啶)]甲酰胺甲磺酸盐,分子式为C25H27N5O3S,分子量为493.58(甲磺酸盐),主要通过高度选择性地强效抑制血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的磷酸化及下游的ERK1/2-MAPK及PI3K-AKT-mT0R通路的活化,阻断信号传导,抑制肿瘤新生血管的生成从而抑制肿瘤的生长。多项体内、外试验发现,阿帕替尼对于多种人类和动物肿瘤,如肺癌、结肠癌和胃癌的裸小鼠移植瘤,具有显著的抗肿瘤活性。目前,阿帕替尼治疗晚期HCC的Ⅱ/Ⅲ期临床研究正在积极开展。本课题主要是探索榄香烯注射液与阿帕替尼联合用药治疗HCC是否具有协同增效作用,进一步研究其抗HCC的作用特点和作用机制。此外,还通过榄香烯注射液诱导HepG2细胞凋亡,再联合自噬抑制剂羟氯喹,旨在探讨抑制自噬对榄香烯注射液诱导HepG2细胞凋亡的影响。[方法]1体内实验1.1构建ICR小鼠肝癌H22皮下移植瘤模型,50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg剂量的榄香烯注射液单药分别用于ICR小鼠,计算抑瘤率,确定有效的单药剂量。1.2以50mg/k、100mg/kg和200mg/kg剂量的阿帕替尼和200mg/kg剂量的PTK787单药分别用于ICR小鼠,计算抑瘤率,评价阿帕替尼对小鼠肝癌H22皮下移植瘤的疗效及毒性,开与PTK787相比较。1.3不同剂量的榄香烯注射液、阿帕替尼联合作用于ICR小鼠,计算抑瘤率,根据药物相互作用指数(CDI)来判断两药联用是否具有协同作用。2体外实验2.1榄香烯注射液对HepG2细胞株的细胞毒性实验：通过MTT法分析榄香烯注射液对HepG2细胞株生长的抑制作用。2.2采用Western Blot法,检测榄香烯注射液对HepG2细胞内cleaved-caspase 3、 cleaved-caspase 9、PARP、GAPDH、Bcl-2、Bax、LC3 Ⅰ、 LC3 Ⅱ等蛋白表达的影响,LC3即自噬标志物微管相关蛋白1轻链3,LC3是自噬体的特异性标志蛋白,通过检测LC3来判断榄香烯注射液对HepG2细胞自噬的诱导作用。2.3在无血清培养基中,榄香烯射液抑制HepG2的凋亡：HepG2细胞在无血清培养基中培养12h,然后用0.05 mg/mL的榄香烯注射液处理,对照组用DMEM。2.4光镜下观察榄香烯注射液和羟氯喹对HepG2细胞的生长状况的影响。2.5采取流式细胞仪检测榄香烯注射液和羟氯喹对HepG2细胞凋亡的影响。3统计学处理采用SPSS 19.0软件,实验数据以均数±标准差(x±s)表示。采用单向方差分析(One-way ANOV A),方差齐性的组间多重比较采用LSD法,方差不齐的组间多重比较采用Games-Howell法。[结果]1体内实验1.1榄香烯注射液对于荷瘤小鼠的抑瘤率与其剂量强度成正比,在一定范围内,榄香烯注射液的剂量越大,抑瘤率越高。1.2阿帕替尼能够明显地抑制小鼠肝癌H22皮下移植瘤的生长,且抑制作用呈现明显的剂量依赖性,其抑瘤作用明显优于PTK787。1.3阿帕替尼200mg/kg联合榄香烯注射液后,随着榄香烯注射液浓度递增,抑瘤率反而递减。2体外实验2.1采用MTT法观察榄香烯注射液对HepG2细胞的生长抑制效果,结果表明榄香烯注射液可以抑制HepG2细胞的增殖,且呈浓度依赖性。2.2 Western blot检测显示,0.1 mg/mL的榄香烯注射液作用16h后HepG2细胞内Bcl-2蛋白表达明显增加,Bax蛋白表达未见明显变化；作用16h后HepG2细胞内LC3 I蛋白表达开始明显增加,作用8h后细胞自噬标志物LC3Ⅱ蛋白表达开始明显增加,提示榄香烯注射液诱导了LC3Ⅱ的累积。0-8h内,Bcl-2/Bax蛋白比率在持续下降,说明细胞内抗凋亡信号被抑制,LC3 Ⅰ/LC3 Ⅱ蛋白比率也在下降,说明细胞自噬作用在加强,但是在16-24h之间,Bcl-2/Bax蛋白比率与LC3 Ⅰ/LC3 Ⅱ蛋白比率同时上升,说明细胞凋亡与自噬开始达到平衡。提示细胞自噬有可能保护细胞免于凋亡。2.3将HepG2细胞在无血清培养基中培养12h,结果显示,与对照组相比,在饥饿状态下,榄香烯注射液组显著降低了HepG2细胞的凋亡。2.4光镜下观察榄香烯注射液联合羟氯喹作用24h后的HepG2细胞。对照组细胞大小均一,呈上皮型贴壁生长,外形为圆形,轮廓清晰,细胞间结构紧密,胞浆均匀透明,折光性好,生长旺盛；经过羟氯喹处理过的细胞,体积变小,逐渐变圆,细胞间接触变松,折光性及贴壁能力变弱;经过榄香烯注射液处理过的细胞拉长,细胞间接触变松,细胞内颗粒明显变多。在药物联合作用后,较对照组和单药组的细胞密度明显变稀,细胞间接触变松,颗粒增多。2.5与对照组比较,榄香烯注射液和羟氯喹组细胞凋亡比率增高,当两药联合后,HepG2细胞的凋亡率较任一单药组的凋亡率均进一步增加。抑制自噬可以促进榄香烯注射液诱导的HepG2细胞凋亡。[结论]1在小鼠肝癌H22皮下移植瘤体内实验中,阿帕替尼200mg/kg联合榄香烯注射液后,随着榄香烯注射液浓度递增,抑瘤效果反而递减,榄香烯注射液与阿帕替尼联合应用没有起到协同增效的作用,可能反而产生拮抗作用。2榄香烯注射液可以诱导HepG2细胞产生自噬,而抑制自噬,可以促进榄香烯注射液诱导的HepG2细胞凋亡。