论文部分内容阅读
目前,受全球变暖、季节变换、昼夜变化以及水体富营养化等因素的影响,使得低氧成为限制军曹鱼(Rachycentron canadum)养殖业稳定发展的主要非生物因素之一,但关于其响应低氧胁迫的策略和应答机制研究仍未见报道。为了提高军曹鱼养殖业的社会效益和经济价值,培育耐低氧新品种成为迫切需要。本研究以军曹鱼幼鱼为实验对象,设计对照组[溶氧(6.64±0.35)mg/L]、低氧组[溶氧(2.64±0.25)mg/L,胁迫3 h]和复氧组[溶氧(6.34±0.15)mg/L,处理8 h、24 h和48h]不同实验。采用氧化应激与能量利用的相关酶活指标来初步探讨低氧胁迫对机体产生的氧化应激反应,同时以c DNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification Of c DNA Ends,RACE)为基本方法,克隆军曹鱼Mn-SOD基因c DNA全长,探究其在低氧胁迫下的表达规律,之后运用mi RNA组学技术初步筛选出参与军曹鱼低氧胁迫的mi RNA。本研究从生理生化水平到分子水平深入研究军曹鱼应对低氧胁迫的机制,旨在为培育耐低氧新品种提供科学参考。主要研究内容及结果如下:1.军曹鱼响应低氧胁迫的氧化应激与能量利用指标:低氧胁迫后,肝脏丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase,GR)活力均显著低于对照组(P<0.05),乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)活性显著高于对照组(P<0.05);肌肉脂质过氧化物(Lipid Peroxidase,LPO)和MDA活性均显著低于对照组(P<0.05),超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和LDH活性均显著高于对照组(P<0.05);肌糖原和肝糖原含量极显著低于对照组(P<0.01),表明鱼体产生了氧化应激反应,出现轻微氧化损伤。复氧8 h、24 h和48 h过程中,肝脏和肌肉MDA、LPO、SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GPx)和GR含量均出现不同程度的升高;在复氧24 h和48 h后,肝糖原含量呈现先升高后降低的趋势;肌糖原含量则在整个复氧过程中显著低于对照组(P<0.05),说明机体的补偿代谢加剧了复氧过程中的氧化应激现象。2.军曹鱼Mn-SOD基因的克隆和序列特征分析:军曹鱼Mn-SOD基因c DNA序列全长为1209 bp,其中包括684 bp的ORF,42 bp的5’UTR和483 bp的3’UTR,编码227个氨基酸。Mn-SOD在鱼体肝脏、脑以及肌肉等各组织中均有表达,心脏表达量最高,肌肉、脑和肝脏次之,脾脏中表达量最低。在低氧-复氧过程中,肝脏Mn-SOD表达量均显著低于对照组。脑组织则异于肝脏,在R24 h后,Mn-SOD的表达量极显著高于对照组(P<0.01),而S3 h、R8 h和R48 h后则无显著性差异。3.低氧胁迫下军曹鱼肝脏相关mi RNA分析:通过对军曹鱼对照组(C组)和低氧组(S组)肝脏进行测序分析,共获得184个保守mi RNA和121个新预测的mi RNA,然后分析了响应低氧胁迫的mi RNA表达情况,筛选出19个差异mi RNA(10个差异上调,9个差异下调)。对差异mi RNA靶基因进行KEGG pathway分析,发现参与鱼体低氧调控的代谢通路有105(38.46%)条,其中参与氨基酸代谢的有12条,如组氨酸代谢(ko00340)以及精氨酸生物合成(ko00220)等;参与能量代谢的通路有淀粉和蔗糖代谢(ko00500)、糖胺聚糖降解(ko00531)以及半乳糖代谢(ko00052)等。表明机体为了应对低氧环境,通过调控转录水平上的一些重要的通路来维持生理活动,如有氧代谢和无氧代谢的转换、减少能量消耗和促进血红细胞增殖等,共同维持机体的稳态。