【摘 要】
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目的顺铂耐药是导致卵巢癌化疗失败的主要原因,从中药中筛选高效、低毒的中药单体作为逆转剂是一种抗肿瘤的新策略。本研究以卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP为模型,体外研究橙皮素（Hesperetin,HST）逆转卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP的耐药性并探讨可能作用的机制。方法1.CCK8法检测各浓度梯度的顺铂处理卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP和卵巢癌细胞A2780的细胞毒性作用,并计算顺
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目的顺铂耐药是导致卵巢癌化疗失败的主要原因,从中药中筛选高效、低毒的中药单体作为逆转剂是一种抗肿瘤的新策略。本研究以卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP为模型,体外研究橙皮素（Hesperetin,HST）逆转卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP的耐药性并探讨可能作用的机制。方法1.CCK8法检测各浓度梯度的顺铂处理卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP和卵巢癌细胞A2780的细胞毒性作用,并计算顺铂的IC50和耐药指数。2.CCK8法检测各浓度梯度的橙皮素对A2780/DDP细胞的毒性及顺铂耐药性的逆转。3.Western blot和细胞免疫荧光技术检测自噬蛋白LC3在A2780/DDP细胞和A2780细胞的差异表达。4.Western blot检测橙皮素对A2780/DDP细胞的自噬相关蛋白（LC3、Beclin1、P62）及AMPK/m TOR通路蛋白表达的影响;MDC染色检测A2780/DDP细胞自噬活性。5.Western blot、q RT-PCR检测橙皮素对A2780/DDP细胞相关凋亡蛋白（p53、Bcl-2、Bax和Caspase3）表达的影响;Hoechst33342荧光染色检测橙皮素对A2780/DDP细胞凋亡形态学改变。结果1.卵巢癌细胞A2780和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP经不同浓度（2.5μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ、40μΜ、80μΜ）DDP干预24h后IC50分别是11.36和62.73,表明A2780/DDP细胞的耐药指数是5.52;不同浓度DDP处理A2780和A2780/DDP细胞48h后IC50分别是10.10和50.85,耐药指数为4.42。2.橙皮素对A2780/DDP细胞的增殖具有抑制作用,并呈时间-剂量依赖关系;选择无细胞毒性浓度（抑制率小于20%）为50μΜ、100μΜ、200μΜ的橙皮素作用于后续逆转实验,50μΜ、100μΜ、200μΜ浓度的橙皮素联合各浓度DDP处理A2780/DDP细胞48h,耐药逆转倍数分别为1.53、1.87、2.61。3.Western blot和细胞免疫荧光技术检测结果提示自噬相关蛋白LC3的表达在A2780/DDP细胞明显高于A2780细胞。4.Western blot检测不同浓度（50μΜ、100μΜ、200μΜ）HST作用A2780/DDP细胞48h,LC3和Beclin1蛋白表达降低,P62蛋白表达升高,同时能下调AMPK/m TOR信号通路蛋白的表达。MDC染色荧光显微镜下观察A2780/DDP细胞自噬泡的情况,空白对照组见较多MDC阳性荧光颗粒且散在分布,经不同浓度的HST处理A2780/DDP细胞48h,可见较少MDC阳性荧光颗粒聚集在胞内,MDC阳性荧光颗粒细胞数随HST浓度增加而逐渐减少。5.Western blot结果显示不同浓度（50μΜ、100μΜ、200μΜ）的HST呈浓度依赖性增加A2780/DDP细胞中p53、Bax和Caspase3蛋白表达,降低Bcl-2蛋白表达,诱导细胞凋亡。随着HST处理A2780/DDP细胞浓度的增加,Bax和Caspase3m RNA表达升高,Bcl-2 m RNA表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。Hoechst33342染色结果提示HST呈浓度依赖性诱导A2780/DDP细胞发生凋亡。结论1.HST在体外抑制A2780/DDP细胞的增殖活性,并能逆转A2780/DDP细胞对DDP的耐药。2.HST作用A2780/DDP细胞可抑制细胞自噬、诱导细胞凋亡,其可能机制通过调节AMPK/m TOR自噬通路中关键蛋白以及依赖p53信号途径,从而增加A2780/DDP细胞对DDP的敏感性。
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