目的:筛选鉴定结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)关键基因,并探讨关键基因PHLPP2在CRC中的预后价值及作用机制。方法:1)从TCGA数据库中获取所有CRC患者测序数据,通过分析样本编码规则将其中同时拥有癌和癌旁组织的配对数据提取出来。用Limma和edgeR分别对数据进行差异表达分析,取二者结果交集作为CRC相关差异表达基因。用Circlize分析差异表达基因的染色体分布,用热图和聚类分析差异表达基因在个体间的表达异质性。通过上述差异表达基因构建基因所对应的蛋白间互作网络,并基于网络节点特征筛选关键基因。RT-qPCR验证关键基因在CRC及癌旁组织中的表达情况。结合临床资料分析关键基因表达与患者病理改变和总体预后的关系。2)在CRC中通过蛋白质质谱数据分析关键基因转录量和蛋白丰度的相关性。免疫组化检测185例人CRC和癌旁组织中关键基因PHLPP2的表达,基于PHLPP2的表达范围及显色程度对其进行半定量,并分析PHLPP2表达与临床病理因素的相关性。单因素Cox分析PHLPP2及临床病理因素与总体生存的关系,从中筛选出与患者预后相关的因素进行多因素Cox分析。ROC曲线比较PHLPP2表达情况与各临床病理因素在预后评估中的准确性。通过Nomogram构建CRC患者个体化评估工具。再次运用ROC曲线比较Nomogram与各临床病理因素及PHLPP2在预后评估中的准确性。3)Western blot检测PHLPP2在六种常见CRC细胞系中的表达。在HCT116及HT29中分别构建PHLPP2过表达和沉默稳转株,用荧光显微镜观察慢病毒转染率,用Western blot和RT-qPCR检测PHLPP2在蛋白和mRNA水平的差异。通过高通量测序分别检测空载病毒组(Cont组)与过表达PHLPP2组(Lv-PHLPP2)HCT116细胞表达谱的改变情况,并对改变进行基因富集分析。流式细胞技术检测上述两种细胞中的活性氧水平及CD133~+细胞比例。用成球实验比较两组细胞中干细胞微球体形成数量的差异,用药物毒性实验检测两组细胞对5-FU及Oxaliplatin敏感性的差异,用成瘤实验检测两组细胞在裸鼠皮下形成移植瘤的体积差异。用Western blot和RT-qPCR检测两种细胞中CD44、CD133、Nrf2和EPCAM的蛋白和mRNA的表达量。用DMSO或者Nrf2激动剂Cyclopamine分别对Lv-PHLPP2 HCT16细胞进行干预,用Western blot检测干性标志物CD44、CD133、EPCAM及Nrf2的蛋白表达量。结果:1)从TCGA全部645例CRC患者数据中经筛选纳入548例,表达谱数据598份。其中50例患者具有癌-癌旁配对表达谱,498例患者仅有癌组织表达谱。Limma及edgeR统计结果的交集基因共计1335个,其中高表达447个,低表达基因888个。差异表达基因大致均匀地分布在1至22号染色体及X染色体上,未发现有差异表达基因来自于Y染色体。上述基因的表达在配对组织间表现出良好的一致性,而其表达在未配对的肿瘤组织中却存在显著差异。从差异表达基因的互作网络中发现四个核心子网,从中分别提取MCODE系数最高基因节点作为关键基因,分别为:PHLPP2、ELF5、TIMP1、CXCL3。上述四个基因的表达与患者临床病理情况及预后均具有显著的相关性。2)PHLPP2(R=0.31,p<0.0001)蛋白表达丰度随其mRNA转录量增高而升高,变化趋势具有显著正向相关性。免疫组化显示PHLPP2蛋白主要表达于细胞包质,于包膜内侧面聚集。PHLPP2在CRC组织中表达显著低于癌旁正常组织(p<0.001),且其表达丰度与年龄、淋巴结转移、淋巴结阳性率、组织分化程度、TNM分期密切相关(p<0.05),而与患者与性别、肿瘤部位、局部浸润、远处转移,清扫淋巴结数量等临床病理因素无显著相关性(p>0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明PHLPP2表达能够显著影响CRC患者的总体生存期(log-rank p<0.001)。多因素Cox风险模型分析提示低表达PHLPP2是CRC患者不良预后的独立危险因素。PHLPP2具有与局部淋巴转移(N分期)相当的预后评估准确性(p=0.105),将其与临床病理因素进行整合构建个体化预后评估工具Nomogram。Nomogram的ROC曲线下面积达到80.1,比联合临床病理因素的预后评估准确性明显提高(p<0.001),并能够对患者的总体预后风险进行差异更显著的分层。3)PHLPP2的蛋白丰度和mRNA转录水平在HT29和HCT116中的都显著低于其它四株结直肠传代细胞系。通过慢病毒转染在HT29和HCT116中干扰PHLPP2表达,荧光转染率均大于90%,Lv-shPHLPP2组中PHLPP2的蛋白表达量显著降低,而Lv-PHLPP2组中PHLPP2的蛋白表达量显著增高。改变PHLPP2表达可影响整个已知转录组中约8%的基因,其中mRNA 53%、假基因27%、lncRNA 3%、miRNA 1%,并可以改变抗氧化基因如PRDX1、GCLC、GPX2,GLCM等的表达。GSEA分析表明靶向差异表达PHLPP2后受影响的基因在Nrf2通路中显著富集。与Cont组相比,Lv-PHLPP2组中细胞ROS水平显著升高,CD133~+细胞群体比例显著降低,微球体形成量显著减少,对5-FU和Oxaliplatin的敏感性显著增加,转移侵袭及划痕愈合能力减弱,形成裸鼠皮下移植瘤的体积显著变小。干预PHLPP2可以显著影响结肠癌细胞干性标志物及Nrf2的表达,在Lv-PHLPP2组中加入Sulforaphane可以部分逆转过表达PHLPP2所致的Nrf2降低,同时提高CRC相关干性标志物CD44、CD133及EPCAM蛋白的表达。结论:在CRC中基于准确的差异表达分析和蛋白互作网络可以更有效地筛选关键基因。关键基因PHLPP2是CRC独立的预后标志物,将PHLPP2表达与现有临床病理因素整合可以进一步提高预后评估效果。在CRC中PHLPP2可能通过Nrf2通路参与肿瘤细胞“干性”调控,从而介导多种肿瘤生物学行的改变。