食管癌是常见的消化道肿瘤之一，全球每年新发约40万例，其中超过25万在中国。特别在河南林县、磁县等太行山地区，食管癌的发病率居世界首位，超到100/100000，是当地恶性肿瘤第一致死原因，成为威胁当地人民群众的主要恶性肿瘤之一。在西方国家，食管腺癌的发病率占食管癌的60％-70％，国内90％以上的食管癌是食管鳞癌（esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）。食管癌患者总体预后较差，约一半患者就诊时已为晚期，自然病程仅6-8个月，5年生存率10％-25％。可以手术的患者约有90％发生复发转移。分期很早的患者(T1N0M0)，5年生存率可达90％，仍有近一半在5年内复发。肿瘤的局部侵犯及远处转移仍是死亡的主要原因，转移复发的防治是当前食管癌研究的热点和重点。近年来，国内外学者不断的研究探讨食管癌发生，转移和复发的机制，以期提高食管癌患者生存率。　　HtrA1第一个发现的HtrA蛋白家族成员，是一种分泌蛋白，通过在关节炎中的上调作用和肿瘤的进展和浸润过程中通过降解细胞外基质显示重要作用。一些研究表明，HtrA1通过下调作用在转化成纤维细胞一些肿瘤的恶性进展中起着重要作用，例如:卵巢癌，黑色素瘤。此外，通过体内和体外实验证明其过表达抑制细胞的生长和增殖，其可能发挥抑制基因的作用。　　有关食管鳞状细胞癌中HtrA1的表达及其与食管鳞状细胞癌发生与发展，转移浸润等关系的研究，迄今尚未见国内外报道。　　鉴于上述，本研究首先采用采用原位杂交技术和免疫组织化学技术，检测食管鳞癌组织和相对应的正常食管黏膜组织中HtrA1mRNA和蛋白的表达，分析其表达与临床病理学参数之间的关系;然后利用RT-PCR技术扩增人HtrA1基因，将其克隆入pcDNA3.1(+)质粒中，用建立HtrA1真核表达载体pcDNA-HtrA1。在EC9706细胞中表达，获得稳定的高表达HtrA1细胞系，观察HtrA1基因表达上调对EC9706细胞增生物学行为及侵袭能力的影响，研究NF-κB信号途径及下游靶基因的表达水平的变化;最后将上调HtrA1表达载体pcDNA-HtrA1转染EC9706细胞，经G418筛选后获稳定转染细胞，扩增细胞后通过皮下注射的方式接种于裸鼠体内，进行裸鼠体内致瘤实验，采用免疫组织化学分析不同处理组EC9706裸鼠移植瘤中HtrA1，Ki-67蛋白的表达，Westernblotting方法检测各组裸鼠移植瘤组织中NF-κB信号途径及下游靶基因的表达水平的变化。　　总之，本实验以HtrA1为分子靶点，探讨其在食管鳞癌发生发展中的作用，共分为三个部分。　　第一部分:HtrA1在食管鳞癌组织中的表达及其预后分析　　方法　　1.采用原位杂交技术和免疫组织化学技术，检测115例食管鳞癌组织和相对应的正常食管黏膜组织中HtrA1mRNA和蛋白的表达，分析其表达与临床病理学参数之间的关系。　　2.采用半定量RT-PCR分析和Westernblotting技术随机选取3例食管鳞癌癌组织和相对应的正常食管黏膜组织中HtrA1mRNA和蛋白的表达，利用Kaplan-Meier生存曲线分析HtrA1mRNA和蛋白的表达与食管鳞癌病人存活时间的关系，进一步分析HtrA1在食管鳞癌中的作用及分子机制，　　3.所有数据均采用SPSS13.0软件进行。免疫组化和原位杂交的结果相关分析采用x2检验。生存根据Kaplan-Meier方法进行分析，采用log-rank检验(Mantel-Cox)。其他数据应用单因素方差分析。统计数据用均数±标准差（(x)±S）表示，以α=0.05为检验水准。　　结果　　1.HtrA1mRNA、HtrA1蛋白主要定位于食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织的细胞质中，食管鳞癌组织中HtrA1mRNA、HtrA1蛋白显著低于正常食管黏膜组织。　　2.HtrA1mRNA、HtrA1蛋白的表达与食管鳞癌病人的性别、年龄和肿瘤分化程度无关，但是与食管鳞癌病人的TNM分期和淋巴结转移密切相关。　　3.低表达HtrA1mRNA、HtrA1蛋白水平的食管鳞癌患者的生存率显著低于高表达HtrA1mRNA、HtrA1蛋白水平的食管鳞癌患者。　　第二部分:HtrA1表达上调对食管鳞癌细胞生物学行为的影响及其分子机制　　方法　　1.利用RT-PCR技术扩增人HtrA1基因，将其克隆入pcDNA3.1(+)质粒中，用建立HtrA1真核表达载体pcDNA-HtrA1。在EC9706细胞中表达，获得稳定的高表达HtrA1细胞系。　　2.观察HtrA1基因表达上调对EC9706细胞增殖、细胞周期、凋亡及体外侵袭力等生物学行为的影响，研究NF-κB信号途径中的关键组份p65、IκBα和p-IκBα及下游靶基因Bcl-2、Bcl-xL、CyclinD1和MMP-9等的表达水平的变化。　　3.统计学处理:应用GeneTools对RT-PCR和Westernblotting的结果进行灰度值分析，重复三次实验。统计学处理应用SPSS13.0统计软件，统计学数据用均数±标准差表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较应用单因素方差分析(One-wayANOVA)，以α=0.05为检验水准。　　结果　　1.成功构建了HtrA1基因真核表达载体pcDNA3.1-HtrA1;转染食管鳞癌EC9706细胞后可以上调HtrA1的表达。　　2.稳定表达HtrA1的EC9706细胞的增殖显著受到抑制，pcDNA-HtrA1组在G0/G1的细胞数的比率明显增高，S期降低，总凋亡率显著高于未处理组和空载体pcDNA3.1组，侵袭能力下降。　　3.HtrA1表达上调介导的食管鳞癌EC9706细胞生物学行为变化可能与NF-κB信号途径的下游靶基因表达变化密切相关。　　第三部分:HtrA1表达上调对食管鳞癌EC9706裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其分子机制　　方法　　1.将上调HtrA1表达载体pcDNA-HtrA1转染EC9706细胞，经G418筛选后获稳定转染细胞，通过皮下注射的方式将扩增细胞后接种于裸鼠，进行体内致瘤实验，观察各实验组裸鼠成瘤期、成瘤大小、瘤体重量及细胞凋亡的情况。　　2.采用免疫组织化学分析未处理组、pcDNA-HtrA1组和空载体pcDNA3.1组不同食管鳞癌EC9706裸鼠肿瘤组织中HtrA1蛋白，Ki-67的表达，Westernblottings方法检测各组裸鼠移植瘤组织中NF-κB信号途径中关键组份p65和p-IκBα及下游靶基因Bcl-2、Bcl-xL、CyclinD1和MMP-9的蛋白表达情况。　　3.统计学处理:应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，统计学数据用均数±标准差((x)±s)表示，多个样本均数比较应用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。　　结果　　1.成功构建了EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤动物模型，可作为研究HtrA1与人食管鳞癌发生与发展，以及浸润与转移关系的动物模型。　　2.pcDNA-HtrA1可以有效的转染到裸鼠肿瘤组织中，通过上调HtrA1的表达可抑裸鼠体内移植瘤的生长，具有体内抑制食管鳞癌细胞的作用。　　3.HtrA1表达上调介导的食管鳞癌EC9706细胞生物学行为变化可能与NF-κB信号途径密切相关。　　结论　　1.首次检测到食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织及食管癌细胞系中存在着HtrA1蛋白表达，HtrA1表达可能在食管鳞癌的发生及进展中发挥重要作用。成为食管鳞癌转移和预后的分子标记。　　2.HtrA1在食管鳞癌中的过表达可能牵涉到细胞增殖、细胞周期、细胞侵袭和凋亡的调控，与NF-κB信号途径的阻断及其下游靶基因的下调密切相关。HtrA1介导的食管鳞癌细胞的增殖抑制有望为食管鳞癌的分子靶向治疗提供理论依据。　　3.成功构建了EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤动物模型，pcDNA-HtrA1可以有效的转染到裸鼠肿瘤组织中。HtrA1的表达具有体内抑制食管鳞癌细胞的作用，与NF-κB信号途径密切相关。