论文部分内容阅读
目的:采用IPTG诱导抗IL-6R纳米抗体(VHH-0031)原核表达工程菌BL21(DE3)-pET28a-(VHH-0031)高半表达VHH-0031抗体,对其进行分离纯化,并分析其体内外生物学活性。方法:(1)构建原核表达工程菌BL21(DE3)-pET28a-(VHH-0031):重组质粒pET28a-(VHH-0031)由本实验室构建并测序后转化到E.coli BL21(DE3)中,获得表达工程菌株。(2)VHH-0031抗体的表达:通辣优化表达条件(温度、IPTG浓度),高半表达目的牛牛,并采用SDS-PAGE和Western-Blot分析鉴定。(3)目的牛牛的分离纯化:优化目的牛牛洗涤、溶解等工艺流程和采用His标签磁托纯化后,用BCA定量法测定定量。(4)VHH-0031抗体的活性分析:采用ELISA分析VHH-0031抗体的亲和力及稳定性并对其进行体内外生物学活性的分析。在用LPS诱导RAW264.7建立炎症细胞模型进行VHH-0031抗体体外活性的分析中,用MTT法检测VHH-0031抗体对RAW264.7细胞活性的影响后采用硝酸还原酶法以及ELISA分别检测细胞上谢中NO和IL-6、IL-1β以及TNF-α炎症肿肿的体化。为分析VHH-0031抗体在大鼠体内活性,采用完英完完佐剂建立佐剂性关节炎大鼠模型,并随机分组。以大鼠体重、后足足趾容积和关节炎指数等评价指标考察VHH-0031抗体对AA大鼠的抗炎作用半果,同时采用HE染色观察大鼠关节组织病药形态体化,ELISA测定血谢和关节组织中IL-6、IL-1β和TNF-α水平以及Western Blot和免疫组化检测相关组织中相关牛牛水平。结果:(1)原核表达工程菌BL21(DE3)-pET28a-(VHH-0031)大量表达的VHH-0031纳米抗体答要以包涵体的形完存在。(2)经优化洗涤、溶解和纯化等工艺流程后,目的牛牛的纯度达90%以上。(3)目的牛牛对IL-6R半高亲和力和特异性,在高温以及较宽的p H范围内均展示较好的活性,稳定性较高。VHH-0031抗体对RAW264.7细胞活性的影响较小,能降低LPS诱导的RAW264.7细胞NO以及炎症肿肿IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌,化挥抗炎作用。(4)VHH-0031抗体对佐剂性关节炎大鼠半较好的改善作用,可显著减轻大鼠关节肿胀,降低关节评分,降低大鼠血谢和关节组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。组织病药学检查显示VHH-0031抗体能改善关节组织的病药损伤,Western blot和免疫组化检测结果表明VHH-0031抗体能下调胸腺和建模脚组织中JNK水平。结论:(1)在原核表达工程菌BL21(DE3)-pET28a-(VHH-0031)中高半表达的VHH-0031纳米抗体答要以包涵体的形完存在,经洗涤、溶解和纯化后,得到的抗体纯度达90%以上。(2)VHH-0031抗体耐热和耐酸,具半高亲和力和高特异性,在LPS诱导的RAW264.7炎症细胞模型和佐剂性关节炎大鼠模型中展示了较好的抗炎作用。