超量表达StTZF5和StAP2a对马铃薯储藏品质的影响

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马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界第四大粮食作物,在保障粮食安全和促进经济发展方面有重要作用,马铃薯消费需求由传统模式现正往采后加工业发展(如薯条,薯片)。为了延长加工周期以及常温贮藏导致的块茎发芽、失水皱缩和病害传播等损失,马铃薯块茎通常低温贮藏。然而,块茎低温贮藏(﹤10℃)导致淀粉-糖代谢失衡,加速淀粉和蔗糖降解为还原糖,出现“低温糖化”现象。高温加工过程中还原糖会与自由氨基酸发生Maillard反应,导致产品褐化,同时生成丙烯酰胺,严重影响产品品质,并危害人类身体健康。前期对马铃薯块茎低温糖化的机理研究主要集中在淀粉-糖代谢过程中关键酶基因的功能上,如调节淀粉合成的关键酶AGPase1,蔗糖分解的转化酶Stvac INV1(INV1),淀粉水解酶StBAM9(BAM9),但是这些基因的转录调节机制仍不清楚,利用低温储藏期分析转录因子(TFs)的表达模式,筛选出可能的候选转录因子。在此基础上,本研究选取两个基因StAP2a和StTZF5基因,进一步解析其在低温糖化中的功能和调节机制。1.马铃薯StAP2a和StTZF5基因的克隆与分析在栽培种鄂马铃薯3号中分别克隆了StAP2a和StTZF5的CDS全长。结果显示,StAP2a编码序列全长1428bp,编码475个氨基酸,在137-198,228-291氨基酸处均含有AP2/ERF domain,通过多序列比对以及进化树分析发现StAP2a属于AP2-like domain基因家族的eu AP2 lineage亚家族。亚细胞定位显示StAP2a定位在细胞核,在酵母和烟草中均具有转录激活活性。StTZF5基因CDS全长1284bp,编码427个氨基酸,在133-159以及168-191位氨基酸处,分别含有两个锌指蛋白结构域,其锌指蛋白类型属于C-X7-C-X5-CX3-H。进化树分析发现StTZF5属于C3H锌指蛋白家族Ⅰ大亚家族。亚细胞定位显示StTZF5定位在细胞核,在酵母和烟草中均具有转录激活活性。2.马铃薯StAP2a和StTZF5基因功能及调节机制分析为了研究StAP2a和StTZF5基因在马铃薯低温糖化中的功能,我们分别构建了超量表达载体p JCV55-AP2,p JCV55-C3H,以低温糖化敏感基因型鄂马铃薯3号(E3)为受体进行遗传转化,并获得了超量转基因株系。将转基因株系和对照E3温室盆栽种植,收获后的块茎分别低温常温贮藏,分析其相关生理生化指标。结果显示,块茎4℃低温储藏后,超量表达StAP2a转基因株系与对照相比显著提高了还原糖含量,淀粉降解加快,炸片褐化程度进一步加深,淀粉酶活性显著升高,转化酶活性显著降低。超量表达StAP2a,提高了StBAM9基因的表达量,降低了转化酶INV1,StTPS(TPS)的表达量,而在常温储藏下还原糖和蔗糖含量并无变化。超量表达StTZF5转基因株系在低温储藏下,明显升高了还原糖含量,淀粉降解率加快,炸片色泽加深,淀粉酶活性升高,转化酶活性降低。StBAM9,Stvac Inv1(INH2)表达量显著升高,StSPS,StTPS基因表达量降低。同样在常温储藏下还原糖和蔗糖并无显著变化。综上结果,StAP2a属于AP2-like基因家族,StTZF5属于C3H基因家族,StAP2a和StTZF5在低温下一方面均通过上调淀粉酶StBAM9的表达,升高β-淀粉酶活性,加速淀粉降解,促进还原糖的积累。另一方面抑制StTPS的表达,可能通过T6P信号间接调节淀粉-糖代谢从而影响块茎的低温糖化现象。
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