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目的:构建基于微流控芯片的肝肾组织培养技术平台,进而在该平台上研究肿瘤细胞外泌体在肿瘤转移中的作用。材料和方法:本实验采用常规紫外光刻胶技术制备SU-8模板,灌注聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS),获得微流控芯片的膜片,打孔后使用预聚物热固化的方法完成膜片与多孔膜的封接,夹具夹紧备用。本实验所用细胞包括人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)、乳腺癌(Breast cancer,BC)细胞系MDA-MB-231和MCF7,分别使用ECM、L-15、DMEM/F12培养液进行培养。微流控芯片组织培养池底部用1:8的Matrigel(BD公司)包被后接种HUVEC,待细胞生长达到紧密连接,使用分子量为10 k Da的FITC-Dextran评价其渗透性。实验动物选取1~2周龄SD大鼠,麻醉后取大鼠的肝和肾组织,使用徕卡活组织振动切片机VT1200S制备直径5 mm厚度250μm的精密组织切片(Precision-cut Tissue Slices,PTS)本文中包括精密肝切片(Precision-cut Liver Slices,PLS)、精密肾切片(Precision-cut Kidney Slices,PKS),置于微流控芯片组织培养池内培养。采用注射泵驱动微通道内的培养液以0.75μL/min恒定流速对PTS进行灌流培养24 h后将培养的PLS、PKS各分为两组,一组用Hoechst33342、Rh-123和PI联合染色,直接鉴定PTS内的细胞活性;另外一组多聚甲醛固定,OCT包埋,苏木精和伊红染色检查组织结构的完整性,使用Ki67抗体进行免疫荧光染色考察细胞的增殖能力,CXCL12抗体进行免疫荧光染色检测PTS趋化因子分泌功能。采用培养0 h的PTS作为对照组。收集MDA-MB-231和MCF7细胞培养48 h的培养基,采用商品化外泌体提取试剂盒Total Exosome Isolation分别提取两种细胞分泌的外泌体。透射电镜成像观察外泌体形态。蛋白质印迹法(Western Blot,WB)鉴定外泌体蛋白表达,具体检测指标包括CD63、CD81、Hsp70、CXCR4、GAPDH。将PKH67标记的MDA-MB-231外泌体加入PTS培养微流控芯片内,与PTS共孵育30 min、60 min,之后考察外泌体的组织趋向性。动物实验选取2周龄的SD大鼠,鼠尾静脉注射PKH67标记的MDA-MB-231外泌体(10μg),24 h后麻醉大鼠,取肝、肾组织,多聚甲醛固定,OCT包埋,制备冰冻切片,DAPI染色,检查外泌体的组织趋向性。利用ELISA试剂盒分别检测PLS、PKS的CXCL12分泌量。外泌体组织趋向抑制实验选取CXCR4受体拮抗剂AMD3100,使用梯度浓度的AMD3100与MDA-MB-231外泌体孵育过夜,然后将外泌体加入PTS培养微流控芯片通道内与组织培养池内的PTS共孵育,考察外泌体的肝趋向性抑制情况。动物实验选取2周龄SD大鼠,在10μg/100μL荧光标记MDA-MB-231外泌体稀释液体系中,加入AMD3100使其终浓度达2μg/m L后共孵育过夜,鼠尾静脉注射,24 h后麻醉大鼠,取肝和肾组织检查外泌体的组织趋向性。结果:本研究构建的PTS培养微流控芯片从下向上依次为:下层PDMS膜片,蚀刻有微通道;聚碳酸酯膜,布满8μm孔径的微孔;中间层PDMS膜片,有2个组织培养池;顶层PDMS膜片,用于封闭组织培养池;整体使用夹具夹紧备用。将大鼠的肝和肾组织制成直径5 mm、厚度250μm的PTS,在PTS培养微流控芯片的培养池内灌流培养24 h。与体外培养0 h的对照组PTS相比较,Hoechst33342、Rh-123和PI联合染色显示两种PTS内的细胞均保持良好的活性,活性率达90%以上;HE切片显示两种PTS均保持完整的组织结构;Ki67染色结果显示PTS内的细胞保持良好的增殖能力;CXCL12染色结果显示PTS保有趋化因子分泌功能。这部分结果提示基于微流控芯片的PTS培养,至少在24 h内可以维持PTS的细胞活性、组织形态结构、细胞增殖能力和趋化因子分泌功能。进而,我们基于该微流控芯片考察了肿瘤细胞外泌体的组织趋向性。从MDA-MB-231和MCF7细胞培养液中分离获得外泌体,电镜检查结果显示外泌体为标准茶托状双层膜结构,WB结果显示外泌体表达典型的标志物,如CD63、CD81、Hsp70蛋白等。基于微流控芯片的外泌体组织趋向性实验结果显示,与肾组织比较,MDA-MB-231外泌体(p<0.001)和MCF7外泌体(p<0.01)具有明显的肝趋向性,且高转移细胞MDA-MB-231比低转移细胞MCF7的肝趋向性更强(p<0.001)。大鼠体内实验结果显示,MDA-MB-231(p<0.0001)和MCF7(p<0.0001)外泌体具有明显的肝趋向性,在肾组织几乎找不到这两种细胞的外泌体,而且在肝组织MDA-MB-231外泌体显著多于MCF7外泌体(p<0.0001)。CXCR4免疫荧光染色和WB结果均显示两种BC细胞均高表达CXCR4,而且WB结果显示BC细胞外泌体表达CXCR4。此前,我们已经分别利用免疫荧光染色法和ELISA试剂盒法证实了PLS中及其分泌的CXCL12量显著高于PKS。这一结果提示CXCL12/CXCR4生物轴可能在BC细胞外泌体的肝趋向性中发挥一定作用。因此,我们使用梯度浓度的CXCR4受体拮抗剂AMD3100处理MDA-MB-231外泌体后,在微流控芯片上考察了AMD3100对MDA-MB-231外泌体肝趋向的拮抗作用,结果发现随AMD3100浓度升高MDA-MB-231外泌体的肝趋向性显著降低,呈明显剂量依赖(0.5μg/m L,p<0.05;1μg/m L,p<0.01;2μg/m L,p<0.001)。大鼠实验同样证实AMD3100可有效抑制MDA-MB-231外泌体在肝组织的定植灶数量(p<0.05)。结论:(1)本研究构建了PTS培养的微流控芯片及其操作方法,基于该芯片的PTS培养24 h内可良好地保持细胞活性、组织结构完整性、细胞增殖能力和趋化因子分泌功能。(2)微流控芯片PTS培养和动物实验结果均证实BC细胞外泌体具有明显的肝趋向性。(3)CXCL12/CXCR4生物轴在BC细胞外泌体的肝趋向性中发挥一定的作用。