基于GPR70的鲜味电化学生物传感器的研究

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味觉是哺乳动物经过长期的自然进化获得的基本感觉之一,它对于生物感知外界环境具有极其重要的作用。仿生味觉传感器是模拟生物味觉感受机制,以味觉感受组织、细胞、受体以及脂质膜、金属、聚合物等材料作为敏感元件,将捕捉到的味觉信号以电流的方式通过二级传感器传递给信号分析系统,从而对味觉物质进行测定。  近年来,已经有研究者基于受体与配基的结合原理对二者之间的相互作用进行了研究。但是,一些研究的方法还有待优化,比如如何对获得的受体进行固定并保障其活性,如何快速、实时地进行检测,提高灵敏度等。味觉传感器的研制对于食品科学与工程、食品营养与安全、饲料加工等多个领域的发展具有广阔的实际应用前景。  本研究是基于电化学分析方法具有的灵敏度高、特异性强、仪器设备相对简单、能够实时监测等优点,使用玻碳电极作为基体电极,结合壳聚糖良好的成膜性,金纳米粒子的生物相容性、电传导性和吸附能力、酶的催化活力和对电极表面的电子传递增强能力,采用自组装的方法固定由中国小鼠卵巢细胞亚型(CHO-K1)异源表达的鲜味味觉受体蛋白,构建了能检测鲜味物质的受体型生物传感器。  通过NCBI查找鲜味受体基因,利用Oligo法进行合成,酶切法连接真核表达载体pcDNA3.1,转化DH5α菌株获得质粒载体,使用脂质体转染法转染至CHO-K1细胞,培养表达获得目的蛋白GPR70。利用紫外可见光光谱扫描、透射电子显微镜对柠檬酸钠还原法制备的金纳米粒子进行了表征,应用循环伏安法、交流阻抗法对电极组装过程进行了表征。基于GPR70的鲜味味觉电化学生物传感器组装的方法为:玻碳电极打磨、抛光,HNO3、无水乙醇、超纯水清洗,H2SO4活化;滴加壳聚糖溶液,干燥成膜;氢氧化钠溶液赫尔超纯水浸泡,干燥;纳米金溶胶中自组装吸附金纳米粒子;GPR70蛋白的溶液中自组装吸附受体蛋白;滴加硫堇-壳聚糖混合物,干燥成膜;置于辣根过氧化物酶-纳米金溶胶中自组装吸附;置于受体溶液中自组装吸附受体;牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点。时间-电流法对谷氨酸单钠盐进行了定量化测定。结果表明鲜味受体传感器能够对谷氨酸钠在5×10-14-7×10-12mol/L进行测定,呈双曲线模式,于是按双曲线进行回归,相关系数为97.45%;在谷氨酸钠浓度为5×10-14-1×10-12mol/L时,谷氨酸钠浓度和检测信号的差值呈线性关系,相关系数为99.15%;通过双倒数法对实验结果进行回归分析,受体-配基相互作用解离常数为1.3164×10-12mol/L。使用该传感器对同一样品进行测定,组内相对标准偏差R.S.D为6.31%,组间相对标准偏差R.S.D为7.83%,说明该传感器的重现性良好;电极保存在4℃的PBS上方,第5天时为最初响应信号的93.67%,第7天时为87.54%,说明该传感器稳定性良好。结果表明:该传感器具有一定的应用价值。  通过仿生味觉受体传感器的研究,我们可以在分子层面上探讨味觉受体与味觉物质(配基)之间的相互作用,基于受体作为敏感元件的传感器的研究,尤其是对于G蛋白偶联受体生物传感器的开发,对受体与配基亲和常数的测定是药物筛选、药效评价和作用机理的重要手段,该传感器能够为药物筛选方法等提供新的思路。
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