机体内积累的过量自由基会产生与许多疾病有关的氧化应激。目前已发现自由基引起氧化应激而导致的肝脏疾病就包括脂肪肝、病毒性肝炎、肝纤维化等。肝脏是自由基攻击的主要器官之一,因此对其进行氧化应激损伤的研究具有代表性。植物化学成分是天然抗氧化剂的的主要来源。大青(Clerodendrum cyrtophyllum Turcz)是中国传统药用植物,在南方地区常被用来治疗众多炎症及伤痛等疾病。本课题组前期研究已发现大青叶提取物在化学检测法中具有较强的抗氧化活性,因此值得做细胞层面上的抗氧化活性评价。本研究中,大青叶经超声提取并用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取为五个不同极性段提取物。采用叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,TBHP)诱导人肝癌细胞(HepG2)氧化应激模型,分别对五段提取物以及大青叶主要成分类叶升麻苷(verbascoside,Vb)进行了细胞保护作用及其机制研究。采用比色法检测细胞存活率、氧化因子(LDH、MDA、ROS)、抗氧化物(GSH)及抗氧化酶(SOD、CAT),使用荧光显微镜及流式细胞仪分析细胞凋亡状况,通过蛋白免疫印记法分析细胞凋亡通路caspase-3。主要研究结果如下:对大青叶五段提取物研究发现,乙酸乙酯、正丁醇、水段在细胞氧化应激模型中,表现出较好的抗氧化活性。通过MTT法检测细胞存活率发现,三段提取物能够提高由TBHP诱导HepG2细胞氧化损伤后的存活率,呈剂量依赖性。在30 μg/mL的浓度下,乙酸乙酯段的细胞活性提高幅度最大,正丁醇、水段次之,二氯甲烷和石油醚段无明显效果。显微镜观察显示,具有细胞保护活性的三段提取物能在不同程度上保持HepG2细胞的正常形态。进一步研究显示,乙酸乙酯、正丁醇、水段提取物预处理HepG2,能够减少LDH泄漏、细胞内ROS含量、MDA含量,增加细胞内GSH含量,增强细胞内SOD活性、CAT活性。深入研究发现,乙酸乙酯、正丁醇和水三段提取物能在不同程度上抑制caspase-3的激活,使cleaved caspase-3蛋白水平恢复正常,即下调TBHP引起的HepG2细胞氧化损伤,进而我们推测,三段提取物能介导caspase-3依赖的线粒体途径,通过抑制caspase-3蛋白表达缓解由TBHP诱导的细胞凋亡。对类叶升麻苷的研究发现,整体上其抗氧化活性与阳性对照丁基羟基甲苯(BHT)相当,优于维生素E(VE)。通过MTT法检测细胞存活率发现,类叶升麻苷能提高HepG2细胞在氧化损伤后的存活率,呈剂量依赖性,作用效果与BHT相当,且优于VE。进一步研究显示,类叶升麻苷预处理HepG2细胞,能减少LDH的泄露,减少幅度在 18.4%～42.4%(BHT:43.7%,VE:32.1%),细胞内 ROS 含量减少 8.1%～34.8%(BHT:32.6%,VE:27.0%),MDA 含量减少 9.4%～39.8%(BHT:36.6%,VE:37.2%),细胞内 GSH 含量增加 80.6%～306.8%(BHT:257.3%,VE:197.1%),SOD 活性增强 31.9%～71.5%(BHT:68.2%,VE:59.0%),CAT 活性增强12.7%～55.9%(BHT:55.1%,VE:50.0%)。另外,通过荧光显微镜以及流式细胞仪检测发现,类叶升麻苷可以缓解细胞凋亡。深入研究发现,类叶升麻苷能抑制caspase-3的激活,使cleaved caspase-3蛋白水平恢复正常,即下调TBHP引起的HepG2细胞氧化损伤,进而我们推测,类叶升麻苷能介导caspase-3依赖的线粒体途径,通过抑制caspase-3蛋白表达缓解由TBHP诱导的细胞凋亡。综上所述,在抵御TBHP诱导HepG2细胞氧化应激的模型中,大青叶的乙酸乙酯、正丁醇和水段提取物表现出较好的抗氧化活性,乙酸乙酯段最为突出,正丁醇、水段次之。因此,乙酸乙酯段提取物可以作为今后抗氧化活性的主要研究对象,是很好的天然抗氧化剂开发来源。另外,类叶升麻苷表现出较好的抗氧化活性,是极好的抗氧化剂,其作用效果与BHT相当,优于VE,并且其抗氧化机制与提取物的基本一致。因此,类叶升麻苷可以作为大青叶抗氧化活性的的物质基础,为其抗氧化功效提供基本依据。