代谢性酸中毒是一种常见的酸碱平衡紊乱，在临床上有很高的发病率和致死率。临床上常见的代谢性酸中毒有乳酸酸中毒、酮症酸中毒、高氯性酸中毒、肾小管酸中毒及毒物（甲醇、乙烯及水杨酸类化合物等）引起的酸中毒等。代谢性酸中毒有很多危害，主要为影响心肌功能、心血管功能、诱发心律不齐、激发炎症反应等，严重可导致患者突然死亡。代谢性酸中毒针对病因治疗无效后应使用纠酸剂。目前，临床上常用的纠酸剂为碳酸氢钠溶液，其通过酸碱缓冲作用来改善代谢性酸中毒。但是，研究表明输注碳酸氢钠溶液会引起细胞内pH降低、高碳酸血症、钠负荷增加等副作用，而且禁用于治疗通气功能不全的代谢性酸中毒及呼吸性酸中毒。其他纠酸剂如氨丁三醇（Tris hydroxymethyl aminomethane，THAM）可能引起呼吸抑制、低血压、低血钾，甚至诱发心室纤颤等副作用，禁用于伴有呼吸窘迫及儿科代谢性酸中毒的救治。目前存在的纠酸剂都有其各自应用的局限性，所以急需研发出一种同时改善细胞内外酸中毒的纠酸剂。丙酮酸钠（Sodium Pyruvate，SP）是丙酮酸的钠盐，在体内以丙酮酸根离子形式存在。丙酮酸根是内源的能量代谢底物，具有较强的抗氧化作用。研究表明，在失血性休克液体复苏中，丙酮酸钠与常用的生理盐水、乳酸林格氏液等晶体液相比，可以提高失血性休克动物的生存率、保护重要器官（例如心、脑、肾、肺、肝和肠）功能，并且能够改善失血性休克引起的乳酸酸中毒。本课题组一直致力于研究丙酮酸钠在失血性休克液体复苏中的保护作用，同样发现丙酮酸钠具有很好的纠酸效果，提示丙酮酸钠可能具有改善代谢性酸中毒的作用。然而，丙酮酸钠能否研发为新型纠酸药物尚需深入研究。失血性休克产生乳酸酸中毒的原因为微循环障碍及氧供不足使细胞处于缺氧状态，诱发细胞代谢紊乱，多器官功能障碍，导致乳酸堆积。丙酮酸钠在恢复血流灌注和组织氧供同时，通过抗炎抗氧化作用保护器官功能，调节细胞代谢紊乱，并且其自身代谢过程中消耗氢离子。因此，丙酮酸钠改善失血性休克引起的乳酸酸中毒的作用究竟是来自于其对酸中毒病因-失血性休克的治疗，还是丙酮酸钠本身具有纠酸作用，目前尚不明确。而失血性休克复苏模型病理生理作用复杂，不利于对其改善代谢性酸中毒作用效果的评价和机制的探讨，所以需要在其他代谢性酸中毒模型中考察丙酮酸钠的纠酸效果。氯化铵诱导的高氯性代谢性酸中毒动物模型，是目前评价纠酸药物的常用动物模型，在此模型中考察丙酮酸钠的纠酸效果及作用机制有重要意义。因为丙酮酸钠溶液具有很低的缓冲作用（丙酮酸pKa=2.49），且其自身代谢过程消耗氢离子，推测丙酮酸钠可能通过不断碱化细胞内液而碱化细胞外液来改善酸中毒。因此需要在细胞内酸中毒模型中评价丙酮酸钠的纠酸效果。本研究拟采用体内和体外实验，研究丙酮酸钠对代谢性酸中毒的作用效果。首先利用氯化铵诱导的大鼠高氯性酸中毒模型，研究三个剂量丙酮酸钠输注对高氯性酸中毒的作用效果，并筛选出有效的丙酮酸钠给药剂量。然后采用丙酸钠诱导的细胞内酸中毒模型，研究不同浓度丙酮酸钠孵育对细胞内酸中毒作用效果。本研究在动物水平和细胞水平评价了丙酮酸钠改善代谢性酸中毒的作用效果，以期为临床救治代谢性酸中毒提供候选药物。一、氯化铵诱导高氯性酸中毒大鼠模型的建立探讨丙酮酸钠对高氯性酸中毒的作用效果，需要建立高氯性酸中毒动物模型。Marta Nowik等在日常用水中添加0.28mol/L氯化铵（含0.5%蔗糖）饲喂3天建立大鼠高氯性酸中毒模型。本研究采用Marta Nowik法建立大鼠高氯性酸中毒，并对氯化铵的饲喂时间进行了优化。实验分为两组，饲喂0.28mol/L氯化铵（含0.5%蔗糖）为模型组（n=10），饲喂0.5%蔗糖为对照组（n=5）。连续饲喂5天，每天分别进行称重，并于0、3和5天分别进行眼眶静脉取血100μl，进行pH、cHCO3-、BE、cCl-、PCO2和PO2的检测。结果表明，饲喂3天后，模型组与对照组相比，大鼠静脉血pH、cHCO3-、BE、cCl-、PCO2和PO2无明显变化（P>0.05）。饲喂5天后，模型组与对照组相比，大鼠静脉血pH、cHCO3-和BE显著降低（P<0.01），cCl-显著升高（P<0.01），PCO2和PO2无明显变化。同时本实验中发现，饲喂氯化铵溶液5天后，大鼠体重增加值与大鼠静脉血pH值呈正相关，并可以拟合一元直线回归方程。说明饲喂大鼠氯化铵5天后，大鼠体重增加值越小，静脉血pH值相对降低的越低，大鼠酸中毒的程度越重。本实验结果提示，在制备氯化铵诱导的大鼠高氯性代谢性酸中毒时，可以将大鼠体重增加量作为评价大鼠机体酸碱状况的辅助指标。应用此方法建立氯化铵诱导的大鼠中重度高氯性酸中毒模型，为丙酮酸钠药效学评价实验奠定基础。二、丙酮酸钠改善大鼠高氯性酸中毒的作用效果采用氯化铵法建立大鼠高氯性酸中毒模型，尾静脉输注不同剂量的丙酮酸钠溶液2mmol/kg（SP1，n=8），4mmol/kg（SP2，n=8），6mmol/kg（SP3，n=8）。输注2mmol/kg碳酸氢钠溶液为阳性对照组（SB，n=8），输注2ml/kg生理盐水为体积对照组（NS，n=8）。于输注后15min（T15）、30min（T30）、60min（T60）、120min（T120）、240min（T240）各时间点眼眶静脉取血100μl，检测pH、cHCO3-、BE、PCO2、PO2、电解质、血糖和血红蛋白浓度的变化。输注240min后，收集大鼠静脉血进行血肌酐、血尿素氮检测。将大鼠处死，取肾组织并进行HE染色，分析其病理变化。结果表明，输注丙酮酸钠后，静脉血pH均有所升高。其中，SP1组与NS组相比无统计学差异。SP2组和SP3组比NS组高且有统计学差异（P<0.01）。SB组与NS组相比，静脉血pH显著升高（P<0.05）。输注SP后，大鼠静脉血T15时pH值比T0时高且具有统计学差异（P<0.05）。输注SB后，大鼠静脉血T30时pH值比T0时高且具有统计学差异（P<0.05）。SP1和SP2组在T15后，pH、cHCO3-和BE值有先降低后升高的趋势。SP3组提高pH效果维持至240min。SB组在T30后，pH、cHCO3-和BE值有降低的趋势，未见升高。丙酮酸钠和碳酸氢钠输注均可以降低由酸中毒引起的高血钙（P<0.05）。丙酮酸钠和碳酸氢钠输注降低血液钾离子浓度（P<0.05）。输注丙酮酸钠后，大鼠静脉血糖SP3组比SP1组高且有统计学意义（P<0.05）。输注240min后，各组血浆中肌酐和尿素氮水平无统计学差异。肾病理切片显示丙酮酸钠不会加重由高氯性酸中毒引起的肾损伤。三、丙酮酸钠改善细胞内酸中毒的作用研究探讨丙酮酸钠对细胞内酸中毒作用效果，需要建立检测细胞内pH（intracellular pH，pHi）的方法。本实验采用BCECF-AM荧光法实时监测细胞pHi变化。优化了激光共聚焦显微镜的参数设置，确定采用双激发光法（激发光波长分别为488nm和440nm，发射光波长为535nm）对细胞内BCECF荧光强度进行检测，并通过计算荧光比值R（R=F（Ex=488nm/Em=535nm）/F（Ex=440nm/Em=535nm））的大小反应细胞内pH的变化情况。本实验考察了不同浓度丙酸钠（20mmol/L和30mmol/L）对EA.hy926细胞pHi的影响，筛选丙酸钠诱导EA.hy926细胞内酸中毒模型的最适浓度。结果表明，20mmol/L丙酸钠组与对照组相比，加载2min和3.5min后R值无统计学差异。30mmol/L丙酸钠组与对照组相比，加载2min和3.5min后R值显著下降（P<0.05）。说明30mmol/L组比20mmol/L组诱导细胞内酸中毒模型稳定。采用30mmol/L丙酸钠溶液诱导EA.hy926酸中毒细胞模型，通过不同浓度的丙酮酸钠溶液共孵育，研究其对酸中毒细胞pHi作用效果。丙酮酸钠孵育浓度分别为33mmol/L（SP1）、66mmol/L（SP2）和100mmol/L（SP3）。生理盐水（NS）为阴性对照。结果表明，生理盐水组对EA.hy926酸中毒细胞pHi无影响。丙酮酸钠三个剂量组均能够引起EA.hy926酸中毒细胞pHi升高。与NS组相比，SP组峰值处的细胞pHi显著升高（P<0.05）。综上所述，体内实验结果表明，输注丙酮酸钠溶液可以改善大鼠高氯性酸中毒，且治疗效果具有明显的剂量依赖性。同时，丙酮酸钠比碳酸氢钠起效快，作用持久。体外实验结果表明，丙酮酸钠可以提高丙酸钠诱导的酸中毒内皮细胞pHi。本研究证实了丙酮酸钠可以改善细胞内外酸中毒，并对其给药剂量进行初步探讨，为其进一步研制成为治疗酸中毒的候选药物奠定了理论基础。