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类风湿关节炎（RA）是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜病变为主的免疫系统疾病,目前临床上尚不能有效根治。抗原依赖性CD4+T淋巴细胞的过度活化增殖和极化偏移被认为是RA发病机制中的关键环节,通过调节体内Th1/Th2细胞或Th17/Treg细胞的平衡可调节机体免疫状态,并实现对RA的发病及病情恶化的控制。钩吻素子是中国钩吻生物碱单体中含量最高的一种有效成分,课题组前期工作在钩吻素子抗RA及其作用机制的研究中,在整体动物水平发现钩吻素子可显著抑制RA模型动物脾脏Th1/Th2、Th17/Treg细胞及血清相关细胞因子的异常升高,提示其对Th细胞的极化偏移可能具有调节作用,进一步的研究发现,钩吻素子对Th细胞极化偏移起始阶段免疫细胞增殖具有显著抑制作用,但其对Th细胞极化偏移调节作用还需要进一步研究确证,其作用机制尤其是作用靶点和作用方式还不明确,有待于深入研究探索。此外,课题组前期研究发现,线粒体18 kDa转位蛋白（TSPO）是钩吻素子重要的体内作用靶点,但其是否有钩吻素子抗RA效应有关以及其在Th细胞极化偏移时的表达情况尚不明确。鉴此,本文首先在原代培养小鼠脾细胞中探明钩吻素子对T细胞活化增殖及细胞周期的影响,进而在离体细胞水平验证钩吻素子对Th细胞极化偏移的调节作用,最后观察TSPO在Th细胞极化偏移时的表达情况以及钩吻素子对其表达的影响。本研究将有助于进一步阐明钩吻素子治疗RA的分子机制,为钩吻素子有望开发为治疗RA新药提供依据。1钩吻素子对小鼠T细胞活化增殖的抑制作用1.1钩吻素子对混合淋巴细胞诱导的小鼠脾细胞增殖的抑制作用制备健康BALB/c小鼠脾脏细胞悬液,使用丝裂霉素C处理作为供体刺激细胞,同时制备健康C57BL/6小鼠脾脏细胞悬液作为受体应答细胞,在此基础上给予钩吻素子（4、0.8、0.16、0.032 mmol/L）共培养48 h,观察其对混合培养淋巴细胞增殖的抑制作用,结果显示钩吻素子可呈浓度依赖性抑制混合培养淋巴细胞的增殖,IC50为1.448 mmol/L。1.2钩吻素子对抗CD3/CD28抗体诱导小鼠初始T细胞增殖的抑制作用为观察钩吻素子对T细胞受体（TCR）交联诱导的初始T细胞增殖是否具有抑制作用,以竞争性TCR抗体刺激T细胞模拟TCR/CD3+CD28共刺激信号诱导初始T细胞活化。提取正常BALB/c小鼠脾细胞并以免疫磁珠纯化获得初始T细胞,与抗CD3及抗CD28抗体共培养96 h后,加入梯度浓度的钩吻素子（15、3、0.6、0.12、0.024、0.0048 mmol/L）继续培养48 h,以BrdU掺入法检测细胞增殖情况。结果提示抗CD3+抗CD28抗体可有效诱导初始T细胞增殖;钩吻素子可显著抑制抗CD3+抗CD28抗体诱导的初始T细胞增殖,作用呈剂量依赖性IC50为3.253 mmol/L,与钩吻素子对混合淋巴细胞反应抑制作用的IC50水平均接近钩吻素子细胞毒性水平,综合二者表现,提示钩吻素子对T细胞活化的第1信号与第2信号具有一定抑制作用,但其作用较弱,可能不是钩吻素子抑制T细胞活化增殖的主要作用环节。1.3钩吻素子对伴刀豆蛋白A（Con A）诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用为进一步探明钩吻素子对Con A诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用,制备正常BALB/c小鼠脾细胞悬液,利用荧光染料CFSE处理后接种于96孔细胞培养板,加入Con A诱导细胞增殖,同时加入梯度浓度的钩吻素子（5000、1250、312.5、78.125、19.531、4.883μmol/mL）共培养48 h,以荧光标记的抗CD3 APC抗体标记后,流式细胞术检测荧光信号。在Con A诱导增殖的小鼠脾细胞中给予钩吻素子处理,结果发现随着钩吻素子剂量增加,CFSE法检测获得的荧光信号图中增殖峰的数量逐渐减少,提示钩吻素子可显著抑制Con A诱导的小鼠脾脏淋巴细胞细胞增殖,与课题组前期以BrdU掺入法检测钩吻素子对Con A诱导小鼠脾细胞增殖的抑制作用结果相一致。1.4钩吻素子对Con A诱导小鼠脾细胞增殖周期的影响制备BALB/c小鼠脾细胞悬液以Con A诱导增殖,同时给予梯度浓度的钩吻素子（93.75、187.5、375μmol/L）共培养48 h后PI染色,流式细胞仪检测。肉眼观察各处理组G0/G1期信号峰形状相似,而S期信号峰则出现随着钩吻素子浓度增加而上抬的趋势,G2/M期信号峰的变化趋势则与之相反。根据细胞周期G0/G1-S-G2/M期进程中各期细胞相对数量的改变,上述结果提示钩吻素子可呈浓度依赖性阻滞Con A诱导小鼠脾细胞增殖的细胞周期进程,使其阻滞于S期。2钩吻素子对离体水平诱导Th细胞极化偏移的调节作用制备小鼠脾悬液,在体外与Con A共培养,同时加入梯度浓度的钩吻素子（20000、5000、1250、312.5、78.125、19.531、4.883μg/mL）,连续培养48 h后,用BD公司的小鼠Th1/Th2/Th17 CBA试剂盒处理,流式细胞仪FACSVerse检测,FCAP软件数据读取,根据拟合的标准曲线,将检测结果代入换算获得炎症细胞因子表达水平。结果显示与对照组比较,模型组IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-4的信号出现向右偏移,提示在Con A诱导下IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-4出现高表达趋势。而钩吻素子处理组与模型组比较,其信号偏移随着钩吻素子浓度增大而呈现不同程度恢复性改变。将测得值代入标准曲线获得各组细胞因子表达水平,钩吻素子对Con A诱导小鼠脾细胞IL-17A、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-4、IL-10及IL-2细胞因子表达水平的改变均呈现不同程度抑制效应。钩吻素子对模型组IFN-γ/IL-4比值的升高具有显著抑制作用,提示其对离体水平诱导的Th1/Th2细胞的极化偏移具有调节作用。钩吻素子可显著降低模型组细胞IL-17A的表达水平,提示其可抑制Th0细胞向Th17细胞的极化,以IL-17A/IL-10比值衡量Th17/Treg细胞相对关系,钩吻素子亦可显著抑制模型组IL-17A/IL-10比值的升高,提示钩吻素子对离体水平诱导Th17/Treg细胞的极化偏移也具有调节作用。此外,钩吻素子对Con A诱导小鼠脾细胞促炎细胞因子TNF-α及IL-6表达水平的升高也呈现显著抑制作用。而在Con A模型组表达水平降低的IL-10与IL-2,给予钩吻素子处理后,高浓度钩吻素子处理组IL-10（1.25-20 mmol/L钩吻素子）与IL-2（0.3125-20 mmol/L钩吻素子）水平均未呈现显著性改变,与Con A模型组比较均无显著性差异,但低浓度钩吻素子处理组可显著升高IL-10（4.88-312.5μmol/L钩吻素子）与IL-2（4.88-78.13μmol/L钩吻素子）的表达。因此综合课题组前期在整体动物水平观察到的实验结果,可确证钩吻素子对Th1/Th2、Th17/Treg细胞极化偏移具有显著调节作用,可恢复RA发病时Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群及其下游致炎/抗炎细胞因子之间的平衡状态而发挥对RA的治疗效应。3钩吻素子处理下调TSPO在Th细胞极化偏移时的表达制备小鼠脾细胞悬液,接种于含Con A及10%血清的RPMI 1640培养基,在接种时分别给予终浓度为500、50μmol/L钩吻素子处理,同时设置培养液仅含10%血清的RPMI 1640培养基为对照组和不含血清RPMI 1640培养基的空白组,经过48 h连续培养后提取各组细胞总蛋白。结果显示,接种于含10%血清RPMI 1640培养基中的小鼠脾细胞TSPO表达水平显著高于空白组,而Con A诱导模型组TSPO的表达量则出现进一步的升高,显著高于空白组和对照组。Con A模型钩吻素子处理组脾细胞β-actin蛋白表达水平与其他组接近,而TSPO表达水平则均出现显著性抑制,显著低于Con A模型组和对照组。提示TSPO在Th细胞极化偏移时高表达,钩吻素子处理后其表达水平下调,该结果支持钩吻素子的抗炎效应,但钩吻素子在调节Th细胞极化时TSPO表达的下调究竟来源于钩吻素子的直接作用还是继发于钩吻素子抗炎作用,还需要进一步研究阐明。上述结果提示1.钩吻素子对免疫细胞的活化增殖具有显著抑制作用,可使细胞周期停滞于S期,其对抗原依赖性T细胞活化起始阶段TCR识别抗原的第1信号与第2信号也具有一定抑制作用;2.钩吻素子对Th细胞极化偏移具有显著调节作用,可恢复Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群及其下游致炎/抗炎细胞因子之间的平衡状态;3.钩吻素子在Th细胞极化偏移时可使TSPO表达水平出现下调。