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目的:对大鼠进行香烟烟雾和氡单独及联合吸入染毒,观察大鼠肺组织和支气管上皮细胞株BEAS-2B中晚期糖基化终产物受体(RAGE)及钙结合蛋白(S100A6)的表达改变,为筛选香烟烟雾及氡吸入致肺癌的早期分子标志物提供实验资料。方法:1、体内实验:(1)香烟烟雾吸入染毒实验:健康雄性Wistar大鼠27只,随机分为9组,分别为5%浓度香烟烟雾染毒5周(5%Sm-5W)、15周(5%Sm-15W)、30周(5%Sm-30W)、60%浓度香烟烟雾染毒5周(60%Sm-5W)、15周(60%Sm-15W)、30周(60%Sm-30W)组以及3个时间点对照组(CSm),每组各3只。染毒组大鼠整体暴露于动式气体染毒装置,香烟烟雾吸入染毒,每次30分钟,每天2次,一周5天。(2)氡吸入染毒实验:健康雄性Wistar大鼠12只,随机分为对照组和低、中、高3个剂量染毒组,每组3只。大鼠置于多功能生态氡室内,每天染毒12小时,由计算机自动控制氡室内氡浓度,使氡及其子体的累积染毒剂量分别达64、121、236WLM(1WLM是指在1.3×108MeV/m3下暴露一个月(170h)接受氡子体α潜能的量)。(3)香烟烟雾与氡联合吸入染毒实验:健康雄性Wistar大鼠9只,随机分为低、中、高3个剂量染毒组,每组3只,对照组3只同香烟烟雾染毒组。香烟烟雾浓度为60%,氡及其子体累积染毒剂量分别为17、34、68WLM。每两周一次常规称量大鼠体重,监测体重增长情况。染毒结束后麻醉大鼠切取右肺,常规病理观察肺组织损伤情况,并做RAGE与S100A6蛋白的免疫组化;左肺提取肺组织总蛋白,以Western Blot法检测各组样品中RAGE和S100A6蛋白的表达情况。2、体外实验:采用人支气管上皮细胞株BEAS-2B,将细胞分为对照组(BEAS-2B组)、5%烟雾染毒组(5%T组)及20%烟雾染毒组(20%T组),每组3个平行样。对数生长期的BEAS-2B细胞以每孔1×10~5/ml的密度接种于Transwell膜上,每孔1.5ml培养基。细胞贴壁后将Transwell膜置于细胞气体染毒装置中染毒,培养基雾化泵入保持细胞湿润,氧气浓度21%,流量10ml/min。每2天染毒1次,每次染毒10分钟。染毒后将细胞从Transwell膜上消化种入培养瓶中,待细胞生长至对数生长期后继续种至膜上染毒,连续染毒两次记为第1染毒代(5%T-1/20%T-1)。完成第1代染毒的细胞接种后继续同样的染毒过程,为第2染毒代(5%T-2/20%T-2),以此类推,共完成8个染毒代。染毒后逐代检测平板克隆形成率、血清抗性、软琼脂克隆形成率,并提取细胞总蛋白,Western Blot法检测RAGE及S100A6在各组的表达情况。结果:(1)氡吸入染毒后,大鼠肺组织的损伤主要表现为支气管粘膜下炎症细胞浸润、肺泡间隔增厚,肺组织充血水肿等。60%香烟烟雾组大鼠还出现支气管腔内上皮细胞脱落和局部肺气肿改变。联合染毒组大鼠肺泡腔内巨噬细胞增多,肺气肿样变明显。香烟烟雾吸入组大鼠体重增长迟缓,其中较高浓度(60%)组更为显著,而香烟烟雾与氡联合暴露组大鼠体重明显下降,与对照组及单独烟雾低、高浓度组相比均有显著差异,但单独氡染毒组大鼠实验前后体重增长无明显降低。脏器系数变化主要体现在睾丸及肝脏,单独或联合染毒后睾丸系数减小,而高剂量氡染毒后肝脏系数增大。(2)香烟烟雾吸入组大鼠肺组织中S100A6蛋白的表达总体呈增强趋势,5%Sm-5W、5%Sm-15W、5%Sm-30W组与对照组相比均有显著差异,而60%Sm-15W、60%Sm-30W组的表达与染毒剂量呈相关关系。氡染毒大鼠各剂量组(64WLM、121WLM、236WLM)S100A6蛋白均高表达,其中121WLM组大鼠表达最强。香烟烟雾与氡联合染毒大鼠中,以L-15W组大鼠肺组织的S100A6表达增加最显著。人支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞经5%和20%香烟烟雾染毒后,S100A6表达量逐代上升,呈现剂量-反应关系。(3)RAGE在各染毒组大鼠肺组织中的表达无明显一致的规律。在5%香烟烟雾浓度组和氡染毒各累积剂量组中为高表达,而在60%香烟烟雾浓度组的表达量却无明显改变。香烟烟雾与氡联合染毒后,RAGE表达为先升高后下降,随着染毒时间的延长和累积剂量的增加,表达逐渐降低。(4)香烟烟雾染毒后,人支气管上皮细胞BEAS-2B可发生恶性转化,表现为细胞形态学改变,抗血清生长能力增强,细胞平板克隆形成率增加,并且获得了锚着独立生长能力。结论:1、香烟烟雾和氡单独或联合染毒均能使大鼠肺组织发生明显的病理改变,特别是联合染毒可导致肺气肿样病变。染毒后体重减轻和脏器系数变化反映了香烟烟雾和氡吸入对大鼠的整体毒性作用。2、香烟烟雾和氡单独或联合染毒后,大鼠肺组织中S100A6蛋白的表达增强,并呈现剂量-反应关系。S100A6有望作为香烟烟雾及氡致肺癌过程中肺组织损伤的早期分子标志物。3、香烟烟雾可在体外引起人支气管上皮细胞BEAS-2B的恶性转化,因此可作为今后研究吸烟致肺癌的细胞模型。