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目的:骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms,MPNs)是一类克隆性造血干细胞疾病,以一系或多系髓系细胞增殖为主要特征。目前已充分证实JAK2、CALR、MPL基因的热点突变区即JAK2 V617F、JAK2 exon12、CALR exon9和MPL exon10能够独立驱动MPNs的发生,提示这些热点区域的突变能够改变该基因编码的蛋白功能进而导致疾病的发生,且这些突变的发现为临床MPNs的诊治提供了更为精准的参考标准。但约有10%-15%的MPNs患者并不携带以上三种基因的热点突变,称之为“三阴性”骨髓增殖性肿瘤(TN-MPNs)。随着二代测序技术的发展,在一些“三阴性”患者中陆续有热点区域外的不典型突变被报道,但临床上难以确定其是否为导致MPNs发生的功能性突变。JAK2外显子13至15区域编码JH2结构域,JAK2V617F包含在该区域内(外显子14),本研究我们主要研究JH2结构域中其它外显子区域13和15中的突变是否能够产生同JAK2V617F一样的功能效应。选取文献已报道的JAK2 L579F突变(外显子13)和JAK2 L624P突变(外显子15)加以分析。该研究对于临床中判断JAK2外显子13和外显子15区域内的不典型突变在“三阴性”骨髓增殖性肿瘤中的功能性判断有一定指导意义。方法:1、实验分组及构建JAK2基因的慢病毒重组表达载体选用小鼠原B淋巴细胞系(Ba/F3)作为本研究的模式细胞,实验分组设计为:JAK2 L579F突变组、JAK2 L624P突变组、JAK2 V617F阳性对照组、JAK2野生组、JAK2空表达载体组及Ba/F3组。JAK2 L579F、JAK2 L624P通过DNA合成技术直接获得cDNA序列,JAK2 WT及JAK2 V617F通过RT-PCR法逆转录获得cDNA。然后通过PCR扩增,随后将JAK2各基因型构入慢病毒重组表达载体pCDH1-MSCV-MCS1-T2A-copGFP中。2、构建稳定表达JAK2 L579F和JAK2 L624P及各对照基因的Ba/F3细胞模型将已经构建成功的各表达质粒分别与包装质粒psPAX2、pMDX1按一定比例通过脂质体lipo2000共转染293T细胞(要求细胞株代数在15代以内)。转染48h后,收集293T细胞上层慢病毒悬液,并通过0.45μM的滤器进行过滤。滤液收集于5ml离心管中,短期保存于-80℃备用。同时,观测293T中绿色荧光蛋白(GFP)的表达分布状况。取无菌24孔板,于超净工作台中依次加入polybrene(6μg/ml)、400μl Ba/F3细胞培养液、Ba/F3细胞(2×10~5个)、1.6ml慢病毒悬液,轻柔混匀。置于37℃5%湿度充分的CO2培养箱培养24h,之后更换含15%FBS的RPMI 1640细胞培养液继续培养。48-72h之后观察各组感染的Ba/F3细胞中GFP的表达。同时,通过流式细胞仪(FACS)测定GFP表达比例,扩大培养已感染成功的细胞株。RT-PCR及Western blots进一步鉴定克隆中目的基因的表达,建立并保存稳定细胞株。3、研究JAK2 L579F和JAK2 L624P在Ba/F3中的增殖作用利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测各组细胞在无因子刺激下的增殖情况。Ba/F3细胞必须依赖IL-3才能生长,故本研究通过将IL-3撤退,测定各组在0-5d的相同时间点内的吸光度情况,每组细胞设立三个对照孔,并以此反映细胞增殖状态。4、JAK2 L579F和JAK2 L624P在无IL-3条件下细胞G1、G2、S期比例分析应用流式细胞仪,检测各组染色标记的细胞G1、G2和S期比例。将撤去IL-3培养48小时的各组细胞用无菌PBS充分洗涤。之后,对细胞进行固定,加入70%的乙醇于4℃条件下放置12-14h。之后,配制PI混合染色液,暗室37℃孵育标记30min,流式分析检测JAK2突变组及各对照组细胞的G1、G2、S期比例。5、JAK2 L579F和JAK2 L624P在JAK2/STAT信号转导通路中的作用分别收集JAK2突变型的Ba/F3细胞及各对照细胞,PBS洗涤细胞3次,每组细胞按4×10~4/mL重悬于不含细胞因子的1640培养基中。48小时后,收集并获取总蛋白。BCA法对蛋白进行定量,Western blots对各组细胞JAK2/STAT通路相关蛋白进行检测分析。6、蛋白晶体构建及分子动力学模拟获取JAK2基因的蛋白序列(Uniprot:P060067),并选择其中精度较高,且包含氨基酸位点L579及L624的晶体进行突变位点的标注。由映射工具PDBSWS进行位点映射,PyMOL作图。采用amber18软件包中的sander模块完成分子动力学模拟。并通过能量最小化、加热、平衡及动力学采样等步骤进行动力学模拟。轨迹数据分析用CPPTRAJ模块完成,结合自由能则采用amber内置的MMGBSA算法。结果:1、各基因重组慢病毒表达载体的构建及鉴定各基因即JAK2 L579F、JAK2 L624P、JAK2 V617F、JAK2 WT、JAK2 MSCV成功构建入慢病毒重组表达载体pCDH1-MSCV-MCS1-T2A-copGFP中。通过水平凝胶电泳比对,条带均在对应位置。同时通过PCR扩增及测序比对,无碱基的错配、丢失或增加。2、各基因稳定细胞模型的构建及鉴定获取各模型相应的病毒悬液,并感染Ba/F3。48h之后,可以观察到各组细胞均表达绿色荧光蛋白。72h后,于流式细胞仪上测定各组细胞的感染效率。结果显示各组细胞GFP的表达效率均大于百分之九十。同时,应用PCR验证目的基因在各组细胞中的均有表达。3、各组Ba/F3细胞模型增殖能力分析及比较通过细胞增殖实验检测各组Ba/F3细胞不依赖细胞因子在不同时间点的生长情况,结果显示JAK2野生型、JAK2空载体型和裸细胞在各相应时间均没有出现明显细胞增殖情况,各组之间无统计学差异(P>0.05);而JAK2L579F组、JAK2 L624P组和JAK2 V617F组在48h、72h细胞均出现明显增殖,与JAK2 WT、JAK2 MSCV和Ba/F3组相比,均有统计学意义(P<0.001)。同时,JAK2 L579F组、JAK2 L624P组的细胞增殖能力与JAK2 V617F组亦有统计学差异(P<0.05)。提示JAK2 L579F和JAK2 L624P具有促细胞增殖效应,但促进能力与热点突变相比略有差异。4、各组Ba/F3细胞模型在无IL-3条件下的周期分析PI对细胞内DNA进行标记,流式分析检测细胞分裂间期中各期的比例。JAK2 WT组G1期比例为95.05%,S期比例为94.8%。在无IL-3条件下,JAK2L579F组、JAK2 L624P组和JAK2 V617F组G1期比例降低,分别为:73.65%、78.7%和67.49%。S期升高,分别为:23.93%、20.93%和30.79%。JAK2 L579F组、JAK2 L624P组与JAK2 V617F组G1、S以及G2比例相比差异无统计学意义(P>0.05),与JAK2 WT组相比差异有统计学意义(P<0.05)。5、JAK2 L579F和JAK2 L624P在JAK2/STAT信号转导通路活化情况JAK2 L579F组和JAK2 L624P组p-JAK2,p-STAT3,p-STAT5蛋白表达水平明显增强,但稍弱于JAK2 V617F组。而JAK2 WT、JAK2 MSCV和Ba/F3组中,JAK2/STAT信号通路相关磷酸化蛋白基本上无活化或仅有弱的激活。6、JAK2 L579F和JAK2 L624P可干扰JAK2蛋白与其底物ATP的结合能力晶体结构显示JAK2 L579F及L624P均可以改变JAK2 JH2空间结构,并且与ATP结合位点也会发生较大改变。分子动力学模拟计算结果显示两突变体与野生型的结合自由能相差一倍以上,均可对与其底物ATP的结合能力造成较大干扰,进而使得蛋白的功能改变。结论:1.本研究我们通过细胞模型实验L579F和L624P突变证实JAK2外显子13和15区域发生的突变能够产生类似JAK2V617F一样的细胞增殖效应,该结果初步提示JAK2外显子13和15区域发生的突变在骨髓增殖性肿瘤中具有驱动效应。尽管在临床分析中该区域突变可以被考虑其为功能突变,但我们仍然需要排除一些无影响的氨基酸变异。2.晶体结构及蛋白分子动力学模拟显示,L579F和L624P均可造成JAK2蛋白空间构象的改变,但此两突变是通过干扰JAK2蛋白与其底物ATP的结合能力导致JH2不稳定;而JAK2V617F则是通过降低JH2结构域αC结构Tm值改变JH2稳定性,但最终效果均是引起JH2区蛋白结构域失去对JH1结构域的抑制效应。