乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着妇女的健康。在我国,特别是发达地区,乳腺癌发病率呈上升趋势[1]。乳腺癌的发病机制至今还没有统一的结论,由于乳腺是众多激素的靶向组织,激素水平的失衡是诱发乳腺肿瘤的重要因素之一[2]。随着对乳腺组织中激素功能及其作用的分子机制的深入研究,人催乳素(human Prolactin, hPRL)和催乳素受体(human Prolactin receptor, hPRLR)在乳腺中的作用及在乳腺癌发病过程中的调控作用引起人们的广泛关注。催乳素可影响乳腺细胞分裂、细胞形态和分泌功能,实验证明,在大多数乳腺癌细胞、乳腺癌组织中催乳素及其受体的表达水平升高。催乳素作用的发挥需要其受体介导,催乳素受体通过激活下游的JKA和STAT等信号途径调节细胞内靶基因表达,在乳腺癌的发生和发展过程中起到重要作用[3]。因此,通过制备催乳素受体的拮抗剂抑制或阻断人催乳素受体介导的信号通路达到防治乳腺癌的目的是很有应用前景的。本研究拟通过噬菌体抗体库技术构建针对乳腺癌病人的噬菌体抗体库,并将hPRLR胞外区蛋白固定在固相载体上,通过多轮的筛选从而获得与靶蛋白亲和力较高的单克隆抗体。目的:以临床确诊的乳腺癌病人的外周血为原料,构建针对乳腺癌病人的大容量人源Fab抗体库。应用噬菌体展示技术,用固相化的hPRLR胞外区蛋白对构建出的噬菌体抗体库进行多轮筛选,以期筛选得到全人源的抗hPRLR的单克隆抗体。方法:(1)收集24例临床确诊的乳腺癌病人的外周血,分离淋巴细胞并提取细胞总RNA。用RT-PCR的方法分别扩增出抗体轻链和重链可变区基因(VH、VLκ和VLλ)。将扩增得到的可变区片段与恒定区基因(CH1、CLκ和CLλ)相连,通过重叠PCR(overlap PCR)技术获得Fab基因片段,克隆插入pComb3XSS噬菌体载体,通过电转化转入E.coli.XL1-Blue中,经辅助噬菌体VCSM13感染后,分离收集噬菌体得到针对乳腺癌病人的Fab噬菌体抗体库,并滴定计算噬菌体抗体库的库容。(2)将His-hPRLR胞外区蛋白包被在ELISA板中,上述噬菌体抗体库与靶蛋白分子经过孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,用胰酶消化结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体继续感染E.coli XL1-Blue得到扩增,从而进行下一轮筛选,经过5轮左右的筛选后,与靶蛋白特异结合的噬菌体得到高度富集。从最后一轮筛选后得到的output中随机挑选50个克隆,经过扩增后ELISA鉴定噬菌体与hPRLR的亲和力。阳性克隆进行可溶性表达,并用Western-blot和Fab-ELISA的方法对筛选到的克隆进行了初步鉴定。结果:(1)通过重叠PCR得到了具有良好多样性的针对乳腺癌病人的Fab片段,构建了噬菌体载体pComb3XSS/Fab。通过多次(约一百次)电转的方法提高噬菌体抗体库的多样性,最终成功构建了库容为1×109的Fab噬菌体抗体库。(2)以hPRLR胞外区为抗原对全人源Fab噬菌体抗体进行了六轮筛选,第六轮筛选的噬菌体抗体收获率较第一轮提高了2.4×102倍。第六轮筛选后得到的50个菌落中,经ELISA鉴定出四株(X8、X10、X19、X30)抗hPRLR抗体。测序鉴定X8、X10、X19为相同克隆(下文统称为X19),将X19质粒转入TOP10中,用IPTG诱导其表达可溶性抗体,发现其在相对分子量25kD~35kD之间出现两条较明显的表达带,Westernblot验证得到相同的结论。将表达蛋白与靶蛋白hPRLR进行Fab-ELISA其亲和力较高。结论:(1)克隆出了具有良好多样性的全人源Fab片段,构建了库容为1×109的Fab针对乳腺癌病人噬菌体抗体库。该抗体库与一般的噬菌体抗体库相比可能在筛选乳腺癌病人高表达的靶蛋白的单克隆抗体方面更有优势。(2)通过六轮的富集筛选的到了一株抗hPRLR单克隆抗体克隆,经过序列分析、Western-blot和Fab-ELISA初步鉴定为阳性克隆。