葡萄(Vitis L.)是世界上重要的经济类果树作物之一,目前生产上广泛栽培种以欧洲葡萄品种为主,其品质优良,但抗逆性普遍较差。冷(冻)害是限制葡萄生长发育的重要环境因子之一,严重影响葡萄的产量与品质,已成为我国北方寒地葡萄栽培中亟待解决的重要问题。山葡萄是葡萄属植物中抗寒性最强的种,并已成为世界葡萄抗寒育种的重要种质资源。Ca2+介导的CBL-CIPK调控网络在植物参与胁迫响应中发挥重要的作用,该调控网络中的一些成员的功能相继在模式植物拟南芥、水稻中被报道,然而有关葡萄属植物CBL、CIPK家族成员参与逆境胁迫响应的功能研究较少。本研究通过挖掘抗寒种质山葡萄CBL-CIPK家族中的关键成员,研究了 VaCBL01和VaCIPK02基因参与逆境胁迫的表达模式、定位、互作蛋白,以及参与逆境胁迫的功能特点。主要结果如下:1、山葡萄VaCBL01基因表达特性及与VaCIPKs蛋白互作分析。VaCBLL01在山葡萄根、嫩梢、卷须、花絮及幼叶中为组成型表达,卷须中具有较高的表达量。VaCBL01受ABA诱导表达,在12 h表达量较高,随后呈下调表达;VaCBL01受4℃低温胁迫诱导呈下调表达。VaCBL01与19个山葡萄VaCIPKs蛋白之间的相互作用的特异性和强度不同:VaCBL01与山葡萄12个CIPKs有强烈的互作;与5个CIPKs互作强度较弱,与2个CIPKs不互作,表明VaCBL01在解码Ca2+信号及形成CBL01-CIPKs复合体后转导信号的过程中起到重要作用。2、山葡萄VaCIPK02基因表达特性、亚细胞定位、转录活性、互作蛋白筛选与鉴定。VaCIPKK02在山葡萄不同组织中为组成型表达,但表达量有差别,其中根的表达较低,卷须中表达相对较高;VaCIPK02受4℃低温诱导呈上调表达,在6h时表达量达到较高。受ABA诱导呈下调表达。VaCIPK02蛋白定位于细胞核、叶绿体及细胞膜。VaCIPK02及VaCIPK02△NAF无自激活活性,但VaCIPK02△S_TKc具有自激活活性。VaCIPK02与山葡萄的4个CBLs互作(VaCBL01、VaCBL04、VaCBL05与VaCBL08);VaCIPK02自身不能形成同源二聚体。筛选山葡萄经-2℃低温诱导的酵母cDNA文库,筛选出20个互作蛋白,通过随机回复杂交验证表明VaCIPK02蛋白与VaPYL9互作。3、山葡萄VaCIPK02基因及其启动子在转基因拟南芥中的功能分析。同源克隆了VaCIPK02基因上游2269bp的启动子序列,构建了 ProaVaCIPK02::GUS融合表达载体,转化拟南芥获得转基因纯合体。GUS组织化学染色结果表明,VaCIPK02启动子受逆境胁迫(NaCl、甘露醇、4℃低温)与激素(ABA)诱导表达强度有差异。通过构建35S::VaCIPK02::EGFP植物表达载体,进行农杆菌转化获得VaCIPK02过表达转基因拟南芥材料,在ABA胁迫条件下,与WT相比,VaCIPK02过表达植株对ABA表现出超敏感性。