酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)二倍体在营养缺陷的条件下,会形成单倍体的休眠细胞,这种细胞被称为孢子。壳聚糖层和二酪氨酸层作为酿酒酵母孢子壁特有的结构,能够赋予孢子抵抗外界环境压力的能力。几丁质是构成壳聚糖层的前体物质,N,N’-二甲酰基-LL-二酪氨酸(N,N’-bisformyl-LL-dityrosine)则是二酪氨酸层的主要组成成分,但壳聚糖层和二酪氨酸层的组装机制目前尚不清楚。在前期研究中,向孢子体外添加甲酰基酪氨酸发现孢子壁表面仍能够形成二酪氨酸,该结果表明酿酒酵母产孢过程中其孢子壁表面存在明显氧化作用,该氧化作用可能与孢子壁表面壳聚糖及二酪氨酸等大分子机制的相互交联有关,但其具体机制尚未明确。为了明确孢子氧化性的作用机制,选定Gmc1p/Fet5p/Fet3p三个均有较强氧化性的多铜氧化酶进行研究。在酿酒酵母中,GMC1/FET5/FET3为同源基因,并且GMC1/FET5为产孢诱导型基因,同时GMC1也能够参与孢子壁的合成,但具体机制尚不明确。通过在dit1Δ和dit1Δgmc1Δfet5Δfet3Δ菌株中表达人类基因HPD检测培养基颜色变化以及体外向dit1Δ和dit1Δgmc1Δfet5Δfet3Δ孢子添加甲酰基酪氨酸检测二酪氨酸合成情况,确定了孢子壁形成过程中具有明显的氧化性,并且该氧化性的确与Gmc1p/Fet5p/Fet3p有关。用Western Blot分析Gmc1p/Fet5p/Fet3p在营养细胞和孢子中的表达水平,发现虽然Gmc1p的表达量明显低于其他两种蛋白的表达量,但是Gmc1p/Fet5p/Fet3p在产孢过程中其表达量均会明显上升,因此可以确定Gmc1p/Fet5p/Fet3p均为是产孢诱导型蛋白。为了进一步明确Gmc1p/Fet5p/Fet3p在产孢过程中发挥氧化作用的具体机制,对其进行了定位分析,结果显示,Gmc1p/Fet5p/Fet3p三个蛋白在产孢过程中均定位于孢子壁周围,能够在孢子壁的合成过程中发挥氧化作用。高效液相色谱分析结果显示,经过纯化与洗涤的gmc1Δfet5Δfet3Δ孢子二酪氨酸含量相较于野生型孢子降低了约50%,说明GMC1/FET5/FET3会影响孢子壁最外层二酪氨酸层的组装。考虑到二酪氨酸层是在壳聚糖层的基础上合成的,因此,进一步分析壳聚糖含量发现dit1Δgmc1Δfet5Δfet3Δ孢子中的壳聚糖含量比dit1Δ降低了60%以上,说明影响壳聚糖层的形成从而影响了二酪氨酸层的组装。另外,鉴于几丁质为壳聚糖的前体物质,本研究检测了酿酒酵母营养细胞中几丁质的含量,发现各突变株在营养细胞中的几丁质含量明显低于野生型的含量。本研究结果表明Gmc1p/Fet5p/Fet3p在酿酒酵母营养细胞中会通过氧化作用催化几丁质分子彼此交联形成稳定的大分子线性结构,而在孢子形成过程中Gmc1p/Fet5p/Fet3p能够通过作用于壳聚糖的前体物质几丁质,使壳聚糖能够形成线性的壳聚糖聚合物,进行正确的壳聚糖层组装,从而进一步促使二酪氨酸层形成紧密的保护结构,最终形成具有极强抗逆性的孢子壁。本文的结果为壳聚糖层和二酪氨酸层形成机制提供了一种新的认知;并且,本文所述的检测方法也可用于研究多铜氧化酶作用的其他结构的组装机制。