论文部分内容阅读
恒定链(invariant chain, Ii)是脊椎动物重要的免疫分子,在MHC递呈抗原中起重要作用。但是对Ii的研究主要集中于人和小鼠,而鸡Ii的研究相对滞后。近年发展的RNA干扰技术是一种强大的基因功能研究工具,被广泛的应用于基因功能的研究和基因治疗。为研究鸡Ii与MHCⅡ类分子的关系,本实验利用RNAi技术构建了4个沉默鸡Ii的慢病毒重组载体并比较了它们的沉默效率。首先,用自行设计合成的4个鸡Ii基因干扰序列经退火形成双链shRNA片段,再将其插入慢病毒载体pLL3.7。应用PCR、酶切和测序鉴定后,将正确的重组慢病毒载体与辅助包装质粒共转染于293T细胞进行病毒的包装,待病毒收获处理后,再感染鸡源巨噬细胞HD-11,最后用荧光定量PCR检测鸡Ii mRNA的相对表达水平。测序结果显示我们正确构建了4个重组慢病毒干扰载体,它们分别被命名为pLL-Ii-shRNA236. pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527 和 pLL-Ii-shRNA539.共转染293T细胞后,培养48h能在荧光显微镜下观察到荧光表达,说明成功包装了慢病毒,分别命名为LV-shRNA236、Lv-shRNA376、LV-shRNA527 和 LV-shRNA539。取48h和72h的细胞培养上清液,经过滤和浓缩后接种293T细胞,逐孔稀释法测得病毒滴度为2×107TU/mL；再分别将重组慢病毒接种鸡源巨噬细胞HD-11,培养72h后荧光显微镜下能观察到绿色荧光蛋白的表达,说明它们具有感染HD-11细胞活性,通过计数荧光细胞比例得知病毒感染效率达到95%以上；荧光定量PCR结果显示,4种重组慢病毒对鸡Ii的mRNA表达均有沉默效应,分别为37%、52%、88%和78%,其中]LV-shRNA527的沉默效率最高,能使鸡Ii的mRNA表达量下调88%。综上所述,本实验成功构建了4个重组慢病毒载体,并根据重组慢病毒载体包装出了高滴度的慢病毒。这些慢病毒具有感染HD-11的细胞活性并且感染效率达到95%以上。同时,它们对鸡Ii基因的表达都有一定的沉默效应,但差异较大,其中LV-shRNA527沉默效率能达到88%。这也预示了shRNA的设计和选择是RNAi实验能否成功的关键,所构建的高效沉默重组慢病毒载体为进一步研究鸡Ii与MHC Ⅱ类分子的关系提供了重要实验材料。