背景与目的:强直性肌营养不良Ⅰ型（myotonic dystrophy type 1,DM1）是一种常见的遗传性肌病,常发病于成年人,伴有多系统疾病与逐步恶化的症状。肌萎缩是临床上常见的肌肉系统受累主要症状之一,严重影响患者的生活质量。骨骼肌卫星细胞（Skeletal muscle satellite cell,SSC）在肌肉再生中起着重要作用。SSC的增殖能力的下降以及数量的减少都会导致肌肉再生的障碍,可出现肌萎缩。DM1病人的肌肉活检中显示SSC存在增殖能力的下降,但具体机制不详。肌盲管样蛋白1（Muscleblind-like Protein 1,MBNL1）在 DM1 的发病中有着重要的作用,MBNL1负责调控RNA剪接工作。然而,MBNL1的作用不仅体现在RNA分子剪切上,MBNL1可以调控神经干细胞的增殖,可以促进神经突的生长。小鼠MBNL1缺失会出现出肌肉萎缩的症状。我们前期利用TALEN基因编辑技术消除了 DM1病人来源的神经干细胞和心肌细胞的毒性RNA,成功逆转了 MBNL1的表型。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）在增殖,自噬,代谢,分化等方面发挥了重要的作用。mTOR在DM1病人的神经干细胞的增殖以及神经突的生长中发挥着重要作用。增殖和自噬关系密切。在DM1果蝇模型中,过表达mTOR抑制自噬可以挽救萎缩的平均飞行面积。同时MBNL1可以调控mTOR信号通路。综上所述,我们提出假设:MBNL1的功能异常是否通过影响mTOR来影响SSC的自噬水平进而影响其增殖。DM1病人体细胞来源的人诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stemcell,iPSC）携带有病人的遗传信息,并且保持了多能分化的特性,可定向分化为SSC。DM1病人骨骼肌卫星细胞疾病模型的建立无疑对研究DM1病人肌萎缩的发病机制提供了很好的工具。本次研究旨在DM1病人体细胞来源的iPSC诱导分化的SSC中探讨其增殖缺陷的可能机制。第一部分DM1骨骼肌卫星细胞存在增殖缺陷方法:正常人体细胞来源的iPSC（DM1-04iPSC）,DM1病人体细胞来源的iPSC（DM1-03iPSC）,DM1-03经过TALEN基因编辑消除了毒性RNA的iPSC（DM1-13-3iPSC）,成功分化为骨骼肌卫星细胞DM1-04SSC,DM1-03SSC和DM1-13-3SSC。免疫荧光染色显示骨骼肌卫星细胞成功表达了标志物Pax7和MyoD;Pax7+MyoD+阳性细胞比例比较三系细胞的增殖能力。（Antigen Ki-67,Ki67）免疫荧光染色比较三组卫星细胞阳性细胞数的差异。CCK8比较三系细胞的增殖能力。通过上述方法,比较正常人,DM1病人来源以及基因修饰过的卫星细胞的增殖能力,明确DM1病人来源的SSC是否和病人肌肉活检结果一致,存在增殖缺陷。核酸分子原位杂交检测DM1-13-3SSC毒性RNA有无消失。蛋白免疫印迹法测定三系SSC MBNL1蛋白表达量。初步确定三系SSC的增殖情况,以及探讨基因修饰是否可以改善DM1 SSC增殖。1、骨骼肌卫星细胞标志物配对盒蛋白Pax-7（Paired box protein Pax-7,Pax7）和生肌分化因子 MyoD（Myogenic Differentiation 1,MyoD）免疫荧光染色,确定疾病模型的建立。2、增殖试剂盒（cell counting Kit 8,CCK-8 Kit）检测比较三系SSC的OD450值,比较增殖能力的差异。3、免疫荧光染色,比较三系SSCKi67阳性细胞数比例。4、核酸分子原位杂交检测SSC毒性RNA,明确DM1-13-3SSC毒性RNA有无消失。5、蛋白免疫印迹法测定三系SSCMBNL1蛋白表达量。结果:1、DM1-04SSC,DM1-03SSC 和 DM1-13-3SSC 三系细胞均成功表达Pax7和MyoD,免疫荧光染色呈阳性。DM1-03组增殖状态的SSCs（Pax7+MyoD+）的比例低于 DM1-04 组（P<0.05）,而 DM1-13-3 组的比例高于DM1-03组（P<0.05）,但低于DM1-04组（P<0.05）。2、CCK8增殖检测显示DM1-03SSC OD450值低于DM1-04组（P<0.05）,而DM1-13-3组的比例高于DM1-03组（P<0.05）,但低于DM1-04 组（P<0.05）。3、三系SSC的Ki67免疫荧光染色结果显示:DM1-03SSC组Ki67阳性细胞数比例显著低于DM1-04SSC（P<0.05）,而DM1-13-3组的比例高于 DM1-03 组（P<0.05）,但低于 DM1-04 组（P<0.05）。4核酸分子原位杂交检测SSC毒性RNA结果显示:DM1-13-3SSC细胞核中均未发现毒性RNA,DM1-03SSC发现有毒性RNA。5、蛋白免疫印迹法测定三系SSC的MBNL1蛋白表达量显示,MBNL1在DM1-03SSC中存在细胞核内滞留现象,细胞核中MBNL1显著高于 DM1-04SSC 胞核内 MBNL1（P<0.05）和 DM1-13-3SSC 胞核内 MBNL1（P<0.05）。结论:DM1-04iPSC,DM1-03iPSC,DM1-13-3iPSC 三系多能干细胞可定向分化为骨骼肌卫星细胞;DM1-03SSC存在增殖缺陷;TALEN基因编辑消除了 DM1-13-3SSC的毒性RNA,提升了其增殖能力,但增殖能力仍低于DM1-04SSC。第二部分MBNL1在DM1骨骼肌卫星细胞增殖中的作用方法:1、腺病毒转染DM1-03SSC和DM1-13-3SSC过表达MBNL1,采用蛋白免疫印迹法和实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real time polymerase chain,qrt-PCR）验证过表达效果。2、Ki67免疫荧光检测比较DM1-03SSC和DM1-13-3SSC过表达MBNL1后Ki67阳性细胞数比例,比较增殖能力的变化。3、增殖试剂盒（cell counting Kit 8,CCK-8 Kit）检测比较DM1-03SSC 和 DM1-13-3SSC 过表达 MBNL1 后 OD450 值,比较增殖能力的变化。4、蛋白免疫印迹法测定三系细胞自噬水平,DM1-03SSC和DM1-13-3SSC在过表达MBNL1后磷酸化mTOR（p-mTOR）和自噬相关蛋白微管相关蛋白 1 轻链 3（Microtubulesas sociated protein light chain 3,LC3）、P62的变化。5、采用 mRFP-GFP-LC3 腺病毒转染 DM1-03SSC、DM1-04SSC 和DM1-13-3SSC,检测三系细胞自噬水平;同时检测DM1-03SSC和DM1-13-3SSC在过表达MBNL1后自噬流水平。结果:1、蛋白免疫印迹法测定DM1-03SSC和DM1-13-3SSC过表达MBNL1后蛋白表达量变化显示:DM1-03SSC+AdMBNL1组MBNL1的表达水平都显著高于DM1-03SSC组（P<0.05）;DM1-13-3SSC+AdMBNL1组MBNL1的表达水平都显著高于DM1-13-3SSC组（P<0.05）;PCR 结果显示:DM1-03SSC 和 DM1-13-3SSC 过表达 MBNL1后MBNL1在RNA水平显著升高（P<0.05）。2、Ki67 结果显示:DM1-03SSC 和 DM1-13-3SSC 的 Ki67 阳性细胞比例在过表达MBNL1后显著升高（P<0.05）,但仍低于DM1-04SSC（P<0.05）。3、CCK8 结果显示:DM1-03SSC 和 DM1-13-3SSC 的 OD450 值在过表达MBNL1后显著升高（P<0.05）,但仍低于DM1-04SSC（P<0.05）。4、蛋白免疫印迹法测定三系细胞自噬水平结果显示:DM1-03 SSC中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率显著高于DM1-04 SSC中的比率（P<0.05）,而DM1-13-3 SSC中的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率显著低于DM1-03 SSC中的比率（P<0.05）,但高于 DM1-04 SSC 中的比率（P<0.05）。DM1-03 SSC中p-mTOR/mTOR和P62水平明显低于DM1-04 SSC中的水平（P<0.05）,而DM1-13-3 SSC 中的 p-mTOR/mTOR和 P62 水平显著高于DM1-03 SSC中的水平（P<0.05）,但低于DM1-04 SSC中的水平（P<0.05）。过表达MBNL1后,DM1 SSC中p-mTOR/mTOR 和P62 的水平升高（P<0.05）,但仍低于DM1-04组（P<0.05）。过表达MBNL1后,DM1 SSC中的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降,但仍高于DM1-04组（P<0.05）。DM1-13-3+Ad-MBNL1 SSC 中 p-mTOR/mTOR 和 P62 的水平高于 DM1-03+Ad-MBNL1 SSC 中的水平（P<0.05）,而 DM1-13-3+Ad-MBNL1 的 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 比低于 DM1-03+Ad-MBNL1 SSC（P<0.05）。5、自噬双标腺病毒免疫荧光结果显示:DM1-03 SSC中GFP/mRFP/cell 显著低于 DM1-04 SSC（P<0.05）,而 DM1-13-3 SSC 的 GFP/mRFP/cell 高于 DM1-03 SSC 但低于 DM1-04 SSC（P<0.05）。MBNL1过表达后,DM1 SSC的GFP/mRFP/cell增加,但仍低于DM1-04 SSC（P<0.05）。此外,DM1-13-3+Ad-MBNL1 SSC 的 GFP/mRFP/cell高于 DM1-03+Ad-MBNL1 SSC（P<0.05）。结论:过表达MBNL1可以显著提高DM1-03SSC,DM1-13-3SSC的增殖能力,这种作用在基因修饰组更明显,但仍低于正常组。第三部分DM1骨骼肌卫星细胞自噬和增殖的关系方法:1、腺病毒转染DM1-03SSC和DM1-13-3SSC过表达mTOR,采用蛋白免疫印迹法和实时定量聚合酶链式反应检测效果。2、过表达 mTOR 后,WB 检测 DM1-03SSC 和 DM1-13-3SSC 蛋白LC3、P62以及PCNA水平变化。3、过表达 mTOR 后,CCK8 检测 DM1-03SSC 和 DM1-13-3SSC增殖能力的变化。结果:1、腺病毒转染DM1-03SSC和DM1-13-3SSC过表达mTOR后,蛋白免疫印迹法和PCR结果显示:DM1-03SSC和DM1-13-3SSC过表达mTOR后mTOR在蛋白和mRNA水平显著升高（P<0.05）。2、过表达mTOR后,蛋白免疫印迹法测定DM1-03SSC和DM1-13-3SSC自噬相关蛋白LC3和P62蛋白以及增殖相关蛋白PCNA相对表达水平结果显示:mTOR过表达后,DM1-03和DM1-13-3 SSC中的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 水平降低（P<0.05）,与 DM1-04 SSC 没有差异（P>0.05）。在mTOR过表达后,DM1-03和DM1-13-3 SSC中P62和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达增加（P<0.05）,但仍低于 DM1-04 SSC（P<0.05）。DM1-03+Ad-mTOR 和 DM1-13-3+Ad-mTOR SSC 之间的 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ没有差异（P>0.05）。DM1-13-3+Ad-mTOR SSC 中 PCNA 和 P62 的表达高于 DM1-03+Ad-mTOR SSC（P<0.05）。3、过表达mTOR后,CCK8检测结果显示:mTOR过表达后DM1 SSCs 的 OD450 值升高,但 OD450 值仍低于 DM1-04 SSC（P<0.05）。DM1-13-3+Ad-mTOR 组的 OD450 值高于 DM1-03+Ad-mTOR 组（P<0.05）。结论:过表达mTOR抑制自噬可以促进DM1-03SSC,DM1-13-3SSC的增殖,这种作用在基因修饰组更明显,但增殖能力仍低于正常。第四部分过表达MBNL1通过mTOR信号通路抑制DM1骨骼肌卫星细胞中升高的自噬促进其增殖方法:MBNL1过表达后,用50 nM雷帕霉素处理DM1-03和DM1-13-3并分为DM1-03 SSC,DM1-03+AdMBNL1 SSC,DM1-03+AdMBNL1+Rapamycin SSC 以及 DM1-13-3 SSC,DM1-13-3+AdMBNL1 SSC,DM1-13-3+AdMBNL1+Rapamycin SSC。1、蛋白免疫印迹法测定p-mTOR/mTOR以及自噬相关蛋白LC3,P62,增殖相关指标PCNA,比较过表达MBNL1后给予雷帕霉素处理在两组细胞增殖以及自噬水平上的变化。2、CCK8测定各组细胞的OD 450值,比较过表达MBNL1后给予雷帕霉素处理引起各组OD 450值的变化。3、Ki67免疫荧光染色测定各组Ki67阳性细胞数比例,探讨雷帕霉素阻断mTOR后,过表达MBNL1在SSC增殖中的作用是否受影响。结果:1、蛋白免疫印迹法测定结果显示:雷帕霉素处理后,DM1-03+Ad-MBNL1SSC 中的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 显著升高（P<0.05）,p-mTOR/mTOR,PCNA 和 P62 的水平显著降低（P<0.05）。DM1-03+Ad-MBNL1+Rapamycin SSC 和 DM1-03 SSC 之间的 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,p-mTOR/mTOR,PCNA和P62水平没有显著差异（P>0.05）。雷帕霉素处理后,DM1-13-3+Ad-MBNL1 SSC 中的 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 显著升高（P<0.05）,p-mTOR/mTOR,PCNA 和 P62 的水平显著降低（P<0.05）。DM1-13-3+Ad-MBNL1+Rapamycin SSC 和 DM1-13-3SSC 之间的 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,p-mTOR/mTOR,PCNA 和 P62 水平没有显著差异（P>0.05）。2、CCK8 检测结果显示:DM1-03+Ad-MBNL1+Rapamycin SSC中的OD 450值显著低于DM1-03+Ad-MBNL1SSC（P<0.05）,而和DM1-03 SSC 没有显著差异（P>0.05）。DM1-13-3+Ad-MBNL1+Rapamycin SSC 中的 OD 450 值显著低于 DM1-13-3+Ad-MBNL1 SSC（P<0.05）,而和 DM1-13-3SSC 没有显著差异（P>0.05）。3、Ki67 免疫荧光染色结果显示:DM1-03+Ad-MBNL1+Rapamycin SSC中Ki67阳性细胞的比例显著低于DM1-03+Ad-MBNL1 SSC（P<0.05）,但 DM1-03+Ad-MBNL1+Rapamycin SSC 和 DM1-03 SSC 两者之间无显著差异（P>0.05）。DM1-13-3+Ad-MBNL1+Rapamycin SSC中Ki67阳性细胞的比例显著低于DM1-13-3+Ad-MBNL1 SSC（P<0.05）,但 DM1-13-3+Ad-MBNL1+Rapamycin SSC 和 DM1-13-3SSC两者之间无显著差异（P>0.05）。结论:过表达MBNL1通过mTOR信号通路抑制DM1-03SSC,DM1-13-3SSC中升高的自噬促进其增殖。