绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)引起的绵羊传染性胸膜肺炎(Contagious ovine pleuropneumonia)是威胁养羊业的重要疾病之一。该疾病遍布我国多个地区,尤其在西部畜牧业发达的地区,造成了巨大的经济损失。自噬(autophagy)是真核细胞对抗应激、维护细胞内环境稳定的一种保守手段,依赖溶酶体的细胞分解代谢过程,用以降解受损或衰老的蛋白质、细胞器等细胞结构。另外,根据研究报道可知自噬在机体抗感染免疫过程中也扮演着重要角色。近年来多项研究表明,MO可对宿主细胞造成极大危害,但MO在感染细胞的过程中是否介导了细胞自噬的发生,以及自噬对MO起什么样的作用目前尚不明确。本实验以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,通过建立MO-Y98感染的细胞模型,从形态观察、基因水平、蛋白水平上检测MO感染后的RAW264.7是否可介导自噬的发生以及重要自噬相关因子的变化,并利用RNAi技术研究巨噬细胞自噬对MO清除的影响。实验结果如下:(1)将MO用Dil染料染色后感染RAW264.7,可见MO聚集在细胞核的周围,表明MO可被巨噬细胞吞噬。(2)免疫荧光结果显示,MO感染RAW264.7 12h后,可见LC3、Atg16L绿色荧光斑点聚集在细胞核周围,观察到自噬体。GFP-mRFP-LC3串联荧光蛋白腺病毒监测MO感染的RAW264.7自噬流的形成情况,发现感染6h自噬体出现,12h、24h自噬溶酶体出现,12h时自噬体数量最多,表明MO诱导RAW264.7后可形成完整自噬流,且在12h时自噬流最为强烈。(3)免疫电镜结果显示,MO感染RAW264.7 12h时,可观察到具有双层膜结构的自噬体和单层膜结构的自噬溶酶体。(4)qPCR和Western blot结果显示,MO感染RAW264.7 6h、12h、24h后,自噬相关因子LC3、p62、Atg5、Atg7在转录水平和蛋白水平明显升高,与同期对照相比,差异性显著。(5)将自噬抑制剂巴弗洛霉素Al加入感染MO的RAW264.7,CCU检测发现在作用18h时,实验组CCU值显著高于同期对照组。结果显示,MO诱导RAW264.7自噬,并参与巨噬细胞对MO的清除。(6)利用RNAi技术沉默RAW264.7自噬关键因子p62和Atg7,感染MO后,进行CCU检测,发现RAW264.7中MO数量增加,表明巨噬细胞自噬被抑制后,降低了对MO的清除能力。综上所述,MO可被RAW264.7吞噬;感染MO后,RAW264.7胞内形成自噬体和自噬溶酶体结构,并且自噬相关调控因子表达上调,表明MO可诱导RAW264.7发生自噬;发现RAW264.7自噬下调后对MO清除能力下降,表明巨噬细胞自噬对MO的清除具有重要作用。本实验证明了MO感染可诱导巨噬细胞发生自噬,且初步研究了自噬在MO诱导的巨噬细胞中的作用机制,为MO与巨噬细胞之间的相互作用提供了理论基础,为进一步揭示MO的致病机制提供新的思路。