脱水蛋白即胚胎发育晚期丰富蛋白第二家族蛋白,其参与多种非生物胁迫(如干旱、冷害、高温、高盐、过氧化和重金属污染等)和生物胁迫(如真菌、细菌、病毒、虫害和杂草等)的调控。脱水蛋白至少含有1个K片段,该片段被认为是参与形成螺旋结构的关键保守序列。研究该蛋白结构、功能、作用机制,以及K片段在其中所发挥作用,为小麦抗逆机制奠定理论基础。脱水蛋白WZY2属于YSK2型,受低温、干旱、厌氧、ABA等诱导。本研究以WZY2为主体构建了4个重组蛋白,分别缺失K1片段、K2片段、Y+S片段和K1+K2片段,命名为ΔK1、ΔK2、ΔYS和ΔK1K2。通过分析WZY2及其重组蛋白对胁迫下大肠杆菌活力、乳酸脱氢酶活性的保护作用,以及它们在小麦叶表皮细胞中的分布和动态变化,探究脱水蛋白WZY2在胁迫中的功能,和K片段在其中扮演的角色。同时,比较了WZY2基因和WZY2蛋白在冬小麦郑引1号和春小麦中国春的地上部和地下部的相对表达量的变化,分析WZY2在不同耐寒性小麦的不同组织中的不同表达策略。通过以上研究,获得了如下结论:1.WZY2能够维持大肠杆菌在不同胁迫(包括低温(0oC)、高温(50oC)、过氧化(2.0mmol/L H2O2)胁迫)下的存活率;表达该蛋白的大肠杆菌对重金属离子的耐受性依次为N i2+>Zn2+>Co2+>Cu2+≈Mn2+;该蛋白在低温(0oC)和高温(45oC)条件下,形成分子盾保护乳酸脱氢酶防止其变性,这种保护优于阳性对照B SA;该蛋白定位于细胞核和细胞质中,在贴近细胞间空隙的部位形成富集区,低温处理后扩散到细胞的其它部位。脱水蛋白W ZY2在多种胁迫中担任了提高细胞(蛋白)耐受性的保护剂功能。2.WZY2与DHN14和WCOR80的对比结果表明,K片段对脱水蛋白的结构、功能起着重要的作用。经过在胁迫中维持细菌生长、提高乳酸脱氢酶低温下活性和在小麦叶表皮细胞中动态变化的实验,说明携带2个K片段的ΔYS蛋白功能与WZY2全蛋白作用相似;含有1个K片段的ΔK1和ΔK2的变化趋势略逊于全蛋白;不含K片段的ΔK1K2的表现弱于ΔK1和ΔK2,强于阴性对照。此外,在小麦叶表皮细胞中未能观察到ΔK1::GFP的荧光信号,暗示了对于WZY2蛋白结构和功能来说,K1片段的存在比K2片段更为必要。从此可以看出,脱水蛋白WZY2保守序列重要性的排序为K1+K2>K1>K2>Y+S。3.脱水蛋白WZY2在冬小麦和春小麦的转录水平和翻译水平表现均不相同,反映了两种小麦不同的耐寒模式。在低温胁迫下,冬小麦的地上部和地下部中W ZY2都表现稳步上升,而且该基因在地上部该基因持续高表达时间较长;春小麦中W ZY2的响应较迅速,地上部的相对表达量急升急降,地下部则是急升缓降。在复温实验的72h内,2个品种的WZY2的相对表达量变化均不大,可能与蛋白功能有关。在低温和复温时,W ZY2在冬小麦中的表达量较高,变化较稳定;在春小麦中则相反;WZY2在2个品种的地上部中的相对表达量均高于地下部。上述结果与WZY2::GFP在冬小麦叶表皮细胞的富集区中存留时间较长相一致。4.首次尝试在离体小麦叶片组织的叶表皮细胞中长时间连续观察脱水蛋白的亚细胞定位和低温胁迫下的动态变化。在未低温处理前的小麦叶表皮细胞中,小麦脱水蛋白WZY2或定位于细胞核,或富集在贴近表皮细胞与叶肉细胞形成的空腔细胞质中(富集区)。在低温胁迫处理中,凡是含有K片段的蛋白均发生移动,而ΔK1K2同GFP均不移动。推测W ZY2参与抑制低温下蛋白的聚集,且K片段对此反应中WZY2的行为有重要影响。