第一部分：ERCC2 rs13181基因多态性在胶质瘤易感性关系的研究研究与目的胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤,约占400%～50%,占颅内恶性肿瘤的81%,青壮年多发,死亡率高,对社会、家庭都是很大的打击。目前对于胶质瘤的治疗取得了很大的进步,当前治疗方法主要包括手术、放疗、化疗、免疫治疗等,多种治疗方案相结合的综合方案已被广泛认同,使得低级别胶质瘤患者中位生存期在8-10年之间；间变胶质瘤患者中位生存期在3-4年之间。对于胶质母细胞瘤中位生存期在14.6—17个月之间,近年来随着放疗与替莫唑胺化疗方案结合,使得将近10%胶质母细胞瘤患者存活至5年以上。基因靶向治疗目前仍处于实验室研究阶段。脑胶质瘤的发生原因目前仍不清楚,在本质上是多种环境因素与遗传的致癌因素的共同作用,导致引起DNA损害,从而激活原癌基因,灭活抑癌基因,此外,凋亡调节基因及DNA修复基因的突变,使靶细胞发生浸润、变化与转移形成。目前发现电离辐射是胶质瘤发生的比较确切的病因,另外脑肿瘤家族史、一些单基因遗传病、神经纤维瘤病1型和2型、视网膜母细胞瘤和结节性硬化症等都与神经胶质瘤的风险相关。胶质瘤发生发展也是在内部遗传易感因素与外部环境致病因素相互作用下,在细胞DNA及表观遗传物质水平发生了足以致癌的突变,研究发现DNA修复基因多态性与胶质瘤有明显相关,相关基因主要有：ERCC1、ERCC2、 RTEL、TERT、EGFR、MGMT和VEGF基因。核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair, NER)是一种重要的DNA修复机制,对抵抗紫外线有重要作用。参与NER的基因主要包括：ERCC1、XPA、 XPB/ERCC3、XPC、XPD/ERCC2、XPE/DDB1/2、XPF/ERCC4、XPG/ERCC5。它们共同构成NER核心蛋白。其中ERCC2是NER机制中最重要的酶之一。目前发现ERCC2 (Excision repair cross complementation group 2,ERCC2)基因位于人类染色体19q13.3,是一种进化保守的ATP依赖性DNA解旋酶,在NER途径中起着重要作用。其包含23个外显子,大小约54kb,转录产物大小为2283bp,由760个核苷酸组成,ERCC2的晶体结构由四部分构成：ERCC2的晶体结构由四部分构成：第一解旋酶模块(HD1)、第二解旋酶模块(HD2)、4FeS、Arch。HD1包括四个保守的基因序列：Ⅰ、Ⅰ a、Ⅱ、Ⅲ。其中,4FeS位于Ⅰ与Ⅰ a之间,Arch位于Ⅱ与Ⅲ之间。HD2则包括Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ三个基因序列。4FeS区域在ERCC2中为打开DNA双螺旋结构的初始部位,把DNA双链变为单链,让5’端单链通过HD1区域和Arch区域,而3’端单链则移动至HD区域外围。Arch区域包括两个拓扑结构(α和β),a为螺旋结构,β链为四股反向平行排列结构,具有可延伸的特性。通过α和β拓扑结构与4FeS区域相互作用,ERCC2通过Arch与CAK(cdk.activating kinase)相结合,促进转录因子IIH (TFIIH)复合物的形成。ERCC2在NER中的作用重要是通过转录因子IIH (TFIIH)来完成的。TFIIH是一个形态类似环形的三维结构。由两个基团构成：8个亚基构成的核心区,包括：ERCC5, ERCC2, ERCC3,p62,p52,p44,p34,TTDA(特殊的修复亚体)；3个亚基构成的CAK(cdk-activating kinase)区,包括：cyclinH,MAT1,cdk7。ERCC2起着支架作用,在MAT1和P44协助下与CAK区紧密结合,作为桥梁将两个亚基连接。NER过程中,ERCC3是ATP依赖的3’一5’端解旋酶、ERCC2是ATP依赖的5’3’端解旋酶,将DNA双链解开。TFⅡH在主要是在损伤部位解开DNA双链,促使特异性的核酸酶对受损伤的DNA片段进行切除。有研究表明即使TFⅡH里的ERCC2被敲除了,其转录功能也不会被影响,但是对受损DNA的修复功能却要受到很大影响,说明了ERCC2在TFⅡH的受损DNA修复功能中处于非常重要的地位。基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。ERCC2 rs13181多态性可导致在核苷酸切除修复的缺陷,和在癌变的过程中DNA修复不足。ERCC2的多态性会降低酶活性,导致NER途径修复能力下降,癌症风险增高。ERCC2 rs13181位于该基因751位点,可能会改变所编码的蛋白质的酶活性,以前研究表明ERCC2 rs13181与各种癌症相关联,如胃癌,食道癌,非小细胞肺癌,肝癌,前列腺癌,皮肤癌和膀胱癌。ERCC2 rs13181多态性与脑胶质瘤的发展之间的关联是不确定的。本研究是通过研究ERCC2 rs13181多态性与脑胶质瘤易感性的关系,进一步说明ERCC2 rs13181与胶质瘤发生发展的关系。方法研究对象胶质瘤患者组：实验收集经组织病理确诊为胶质瘤患者资料,本研究中共有165例脑胶质瘤患者,根据世界卫生组织(WHO)的分类分级。对照组：随机选择330例同期我院门诊患者和体检健康者无脑胶质瘤患者,并排除与癌症或中枢神经系统相关的疾病和先前接收放疗和化疗其他疾病患者。对研究对象,设定调查相关内容,包括以下几方面：研究对象的一般情况,如性别、年龄、婚姻、爱好、健康情况、家庭经济状况等；1.外界环境与胶质瘤相关的重要危险因素；2.主要危险因素,包括家族肿瘤史,颅脑损伤,颅内感染等与胶质瘤发生密切相关的疾病史等。收集两组的外周血标本,提取DNA后用PCR反应扩增ERCC2 rs13181基因序列,再采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism PCR-RFLP)的方法对PCR反应产物进行基因型分析。统计学处理1. Hardy-Weinberg平衡检验：在进行关联分析之前,要先进行Hardy-Weinberg平衡检验,等位基因A1、A2的频率分别为p和q,(p+q)2=p2+2pq+q2=1,p2为野生型基因型频率,2pq为杂合型基因型频率,q2为突变纯合型基因型频率,假设前提为为以群体处于Hardy-Weinberg平衡状态,采用χ2检验进行检验,确认研究样本的群体代表性。2.危险因素分析：采用SPSS 18.0对数据进行分析,实验结果以均数±s表示,两组间比较均数差异的显著性检验用t检验,p<0.05被认为有统计学差异。采用χ2检验及t检验进行分析。3.等位基因频率、基因型频率分析：采用Logistic回归分析。4.分层分析ERCC2 rs13181与环境因素的交互作用。结果胶质瘤组与对照组相比,性别、吸烟、饮酒、肿瘤家族史无明显差异；在共显性模型和隐性模型中,ERCC2 rs13181GG型增加胶质瘤的风险；环境因素(包括年龄,性别,吸烟和饮酒等因素)对ERCC2 rs13181多态性与胶质瘤的风险没有影响。结论在共显性模型和隐性模型中,ERCC2 rs13181GG型增加了脑胶质瘤的风险,这表明该基因多态性可能影响脑胶质瘤的病因相关。然而,需要具有更大的样本量的研究来证实这些发现。第二部分：基于过表达胶质瘤细胞模型研究ERCC2对胶质瘤细胞生物学功能的初步研究研究与目的胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤,约占40%～50%,占颅内恶性肿瘤的81%。胶质瘤的病因仍不清楚,在本质上是多种环境因素与遗传的致癌因素的共同作用,导致引起DNA损害,从而激活原癌基因,灭活抑癌基因,此外,凋亡调节基因及DNA修复基因的突变,使靶细胞发生浸润、变化与转移形成。P53是一个重要的抗癌基因,使癌细胞凋亡,从而防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。TFIIH解旋酶做为p53依赖的凋亡途径的成员之一,有助于DNA修复的功能,是p53依赖途径机制所需要的。此外,ERCC2具有促进p53负调控多种缺乏p53的结合位点基因的作用。野生型p53基因在非转录修复和积极转录修复过程中都需要的基因,参与调解细胞周期阻滞及凋亡的过程。据研究发现ERCC2解旋酶与p53C-末端结构域结合,有助于其促进凋亡活性。从有癌症倾向患者中的成纤维细胞的研究中发现,ERCC2缺陷引起p53依赖的凋亡能力不足。ERCC2的高表达具有诱导肿瘤细胞凋亡的功能。然而,ERCC2解旋酶如何上调p53蛋白表达,目前尚不明确,可能与癌症转化过程中的DNA修复功能缺陷有关。研究表明c-myc在胶质瘤细胞中表达增加,c-myc能诱导的DNA氧化损伤,下调DNA修复功能,促进癌症的发生发展,还有实验结果表明,在ERCC2缺陷或突变的细胞中,c-myc基因表达量增加。在TFIIH参与的转录过程,可以被FBP干扰抑制子(FIR)阻断,c-myc的表达被抑制是通过FBP结合c-myc基因的单链上游活化元件(FUSE)来实现的[17]。当ERCC2发生突变时,FBP的活化被突变型ERCC2阻断,而FBP的活化可以导致c-myc出现表达下降。ERCC2缺陷的细胞在被转入FBP或ERCC2后,c-myc表达可被抑制。ERCC2负性调节cdK7和CAK活性,发挥调节细胞周期进程的功能。作为TFIIH的一部分,CDK7可磷酸化其他激酶,是cdk2激活过程中必不可少的一步]。多余的ERCC2调节CAK活性,导致在cdK磷酸化,减少细胞分裂,和增强细胞的杀伤力。因此ERCC2的减少,导致CAK活性增强,促进细胞增殖。下调XPD这样似乎有助于有丝分裂CAK活性升高和正向调节有丝分裂。此外,ERCC2还通过抑制c-myc抑制CDC25A的表达,进而抑制了cdK2的活性,从而抑制了DNA复制的发动。CDK2是细胞周期的关键性激酶,在细胞周期进入S期和DNA复制过程中发挥其重要作用。有研究证实cdK2可以被CDC25A去除抑制性的磷酸根,从而受到抑制,从而被活化。研究表明多种肿瘤细胞中,CDC25A 的表达都会受到ERCC2的抑制。ERCC2能编码一个高度保守的DNA解旋酶,是DNA修复,复制,重组和转录过程中所必需。特别是作为NER途径的重要成员,ERCC2在基因组的完整性起着举足轻重的作用。如果ERCC2编码的解旋酶有缺陷,将导致具有癌症的倾向人类综合征,和基因组不稳定性。在肝癌的研究中,因为ERCC2基因表达水平往往是下调,并且该基因功能受阻,据文献报道ERCC2导致细胞活力下降,促进肝癌细胞周期阻滞和凋亡,逆转肝癌的恶性表型。在本研究中,我们通过研究ERCC2基因对胶质瘤细胞体外生物学效应,及p53、c-myc和cdK2表达的影响,初步分析ERCC2基因与胶质瘤发生发展的机制。方法研究对象将第一部分实验所获得的野生型ERCC2(ERCC2 rsl3181TT)的DNA扩增产物与pcDNA3.1质粒(美国Invitrogen公司)混合在一起,然后用限制性内切酶进行双酶切。酶切产物切胶回收后用高效DNA连接酶：16℃连接16h；将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细菌。使用G418平板筛选,挑取阳性克隆,摇菌过夜,最后提取质粒。将构建的重组质粒命分别命名为pcDNA3.1/ERCC2。将pcDNA3.1/ERCC2转染入人胶质瘤U251细胞,同时将空质粒pcDNA3.1转染的人胶质瘤U251细胞和未转染的人胶质瘤U251细胞作为对照组。统计学处理SPSS18.0统计软件行组间方差分析,以P<0.05为差异有显著性,结果以Mean±SD表示。结果1.体外转染细胞模型构建成功2.各组中ERCC2 mRNA和蛋白的表达情况,RT-PCR检测结果发现,与对照组相比,pcDNA3.1-ERCC2组细胞中ERCC2表达量明显增加。经过Western Blot检测发现,与对照组相比,pcDNA3.1-ERCC2组细胞中ERCC2蛋白翻译明显增加。3.转染48 h后的各组细胞,分别采用Annexin V-PI双染法,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用WinMDI 2.9软件对各组的凋亡率进行分析各组的凋亡率,统计学分析P<0.01,有显著的意义。4. Cell Counting Kit-8(CCK8)方法检测各组细胞增殖水平的变化。分别在细胞转染的第24小时,第48小时和第72小时收集细胞培养悬液,用分光光度计测定450nm吸光度(A450),测得各个时间点的吸光度值。我们发现pcDNA3.1-ERCC2组细胞细胞增殖受到抑制,48小时(p<0.05)；72小时(p<0.001)5.各组中p53、c-myc和cdk2等相关分子的表达情况。经过研究发现,与对照组相比,pcDNA3.1-ERCC2组细胞中p53表达量明显增加,C-myc、cdk2表达量明显下降。经过Western Blot检测结果,与对照组相比,pcDNA3.1-ERCC2组细胞中p53蛋白表达量明显增加,C-myc、cdk2蛋白表达量明显下降。结论ERCC2可以主要阻滞细胞周期进程,诱导胶质瘤细胞凋亡,抑制细胞活性,上调p53的表达,抑制c-myc和cdK2的表达。我们进一步推测,ERCC2基因可能为胶质瘤的基因治疗提供新的思路。