目的：伴随工业、农业和交通事业的发展，高能量创伤日益增多，周围神经损伤已成为临床上比较常见的致残性损伤，而针对周围神经损伤的治疗一直是临床上比较棘手的问题，尽管显微外科修复技术已经十分精湛，但长期以来难获得满意效果。随着分子生物及基因工程的发展，当今针对基因治疗研究已成为周围神经损伤研究领域的热点课题。通过研究发现在中枢和周围神经系统中把携带目的基因的腺病毒作为载体(Adenovirus,AdV)导入后，目的基因就会适时地表达产物，从而达到治疗或者研究的目的。其中在介导基因转染方面腺病毒载体具有诸多优点，因此在神经示踪研究、神经再生和神经运动系统疾病的诊治中成为应用最广泛的载体。在神经系统内导入以腺病毒作为载体的目的基因，通过目的基因在神经系统内的表达促进周围神经的再生，同时也对神经示踪的研究的具有重要意义。当下，神经修复研究领域的热点是将各种神经营养因子基因融合到复制缺陷型重组腺病毒（Adenovirus,AdV）中，再将携带目的基因的腺病毒转入到脊髓或周围神经中来对受损的神经元进行保护或者在周围神经系统中诱导周围神经的再生过程。腺病毒载体具有较高的感染效率、广泛的宿主范围、可以将分裂期或静息期细胞感染、巨大的基因装载量、容易提取高浓度病毒成分、毒性低水平表达等优点。利用分子生物技术克隆乳糖操纵子基因片段LacZ基因构建腺病毒载体，制备病毒颗粒从而为进一步研究腺病毒载体介导的LacZ基因在周围神经损伤中的应用。LacZ基因广泛用于基因表达调控研究中的一种基因。LacZ基因编码的beta一半乳糖普酶（简称beta-gal)是由4个亚基组成的四聚休，可催化乳糖的水解．Beta-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色，便于检测和观察．LacZ基因的诸多优点使它成为基因工程实验中的一个常用标记基因，因此它被用于基因的时空表达、探测已知调控序列有效区段的位置和作用、寻找未知序列等领域。因此，利用腺病毒安全、稳定、高效以及LacZ基因特异性表达等特点当下利用含LacZ基因的腺病毒对周围神经损伤修复进行研究已成为基因治疗的前沿。但腺病毒可以被中和抗体迅速地清除，这是由于腺病毒载体的免疫原性比较强，在日常工作生活中腺病毒侵入人体后会诱发机体产生抗腺病毒中和抗体。如果接受腺病毒载体介导的基因治疗后因为中和抗体会消灭腺病毒载体，从而导致腺病毒载体在体内的数量减少而使基因治疗失败。为了达到持续时间长、表达效果确切等效果，本实验将已有腺病毒通过转染至293细胞，通过在293细胞中的繁殖，从而提取出具有侵染力的浓缩的高纯度病毒。为下一步和今后研究将LacZ基因导入AdV后在中枢和周围神经系统内的表达来促进周围神经的再生奠定基础。方法：1HEK293细胞的培养把冻存的细胞由-196℃的液氮中快速放入37℃水浴中融化，放入后缓慢摇晃冻存管，使细胞外冰晶融化。3000r/min离心3min融化好的细胞悬液。将上层的上清液吸去，并放入10ml培养液到离心管中，轻轻吹打成悬液，放入细胞培养瓶中。将盛有细胞和培养液培养瓶在培养箱中培养。培养箱的环境接近人体环境，为37℃和5％CO2。当细胞生长均匀时，便可计数一定体积细胞悬液中的细胞数。然后根据公式换算出细胞在每毫升细胞悬液中含有的量。细胞生长到占瓶底面积的90％还需要2-3次传代培养。显微镜下观察细胞，挑选形状饱满、生长能力强的细胞接种病毒。2病毒转染把293细胞放入75cm2培养瓶中后加入10mlDMEM5％进行培养。待细胞生长至60%-70%时将培养液倒去，小心加入病毒混合液。十字形轻轻晃动培养瓶使培养液盖住细胞层。放入培养箱中培养90分钟后加入9mlDMEM5％，再经过72小时孵育，便可以通过MOI测定来判断病毒颗粒。3腺病毒扩增将细胞在-20℃到37℃分别放置半小时，反复三次。用离心管离心后收集上清液冰冻存于-20℃或-80℃。取三瓶培养理想的293细胞，倒掉里面的细胞培养液，将5ml混合液放到每个培养瓶中，轻轻晃动混匀。放到培养箱中孵育，时间大约为90分钟。向培养瓶中加入DMEM，继续培养，时间大约48-72小时。同样的方法从第一次被转染的细胞中取上清后再次转染细胞。便可得到再次扩增的病毒。4病毒的纯化离心细胞，待细胞碎片沉淀后取上清液。5mlPEG8000放入每10ml上清液中，将上清放到冰上1小时使其沉淀。以12000rpm的速度离心上述混合物，时间大约20min。将上清液倒去后，在CsCl溶液中加入沉淀物。经过5分钟离心，收集病毒悬浮液。550%组织培养感染剂量法测定病毒滴度取293细胞一瓶，用2%FCS/DMEM将细胞浓度调整为为7.5×105/ml；将100μl细胞悬液分别放到2块96孔板中。10孔为一个稀释度，其中2孔作为阴性对照；经过10天培养后镜下观察，数出每一排出现细胞病变现象（CPE）的孔的数目。并利用Karber方程计算滴度T=101+d(s-0.5)，测出AdLacZ病毒液的TCID50：1010TCID50/ml。结果：1正常具有活力的HEK293细胞呈多角形，贴壁较疏松，细胞之间相互连成网状，并有聚集成团的倾向。2含lacz基因的腺病毒转染后的293细胞在培养24小时后即可在倒置显微镜下观察到细胞变性即CPE现象而且通过Ｘ－ｇａｌ染色后可观察到细胞出现蓝染，即检测到报告基因lacz的表达，细胞表达出携带目的基因的腺病毒颗粒，对照组未发现蓝染表达。表明转染成功。3在96孔板上培养293细胞，用获得病毒感染293细胞后计数出现CPE孔个数，测定病毒滴度。最后获得病毒滴度为1010TCID50/ml（1×109pfu/ml）。结论：成功的纯化了AdLacZ腺病毒，并通过提高了病毒液滴度，为周围神经再生机制的研究及神经损伤的基因治疗奠定基础。利用50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度，最终得到滴度为1010TCID50/ml（1×109pfu/ml）的病毒液，为进一步实验开辟了道路。