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目的本课题选择人骨肉瘤耐药细胞株MG63/ADM,运用无血清悬浮培养的方法,从当中分离出具有干细胞特性的细胞球细胞,采用一系列相关的实验检测方法来鉴定其肿瘤干细胞的特性,最后通过体外实验观察片仔癀对骨肉瘤MG63/ADM细胞球细胞增殖活性的影响,及对ABC膜转运蛋白ABCB1、ABCG2表达的调控作用,从而更深入剖析片仔癀对骨肉瘤多药耐药(MDR)的逆转作用到底与骨肉瘤干细胞的关系如何,使此基础实验能更有效的服务于骨肉瘤临床治疗。方法1、人骨肉瘤MG63细胞阿霉素耐药株的建立及无血清培养细胞球干细胞特性鉴定采用大剂量(2μg/ml)的阿霉素(ADM)短期间歇性的作用于人骨肉瘤MG63细胞,诱导建立骨肉瘤阿霉素耐药株,命名为MG63/ADM,运用MTT的实验方法对ADM的耐药指数进行测定,以及对紫杉醇、顺铂等的药物敏感性；采用无血清悬浮培养MG63/ADM细胞,获得第3代细胞球细胞,CCK8检测ADM对第3代细胞球细胞增殖抑制作用；体外细胞克隆实验、单细胞成球能力形成实验,检测MG63细胞、MG63/ADM细胞及第3代细胞球细胞的增殖形成能力；激光共聚焦和Western blot检测干细胞标志物Oct-4、Nanog、 SOX2在MG63、MG63/ADM、第3代细胞球细胞中的表达。2、ABCB1、ABCG2在第3代细胞球细胞中的表达及片仔癀对3代细胞球细胞的作用采用激光共聚焦检钡ABCB1、ABCG2在MG63、MG63/ADM、第3代细胞球细胞中的表达。CCK8检测片仔癀对第3代细胞球细胞增殖抑制作用,并镜下观察片仔癀对第3代细胞球细胞的影响；RT-PCR和Western blot检测片仔癀对第3代细胞球细胞ABCB1、ABCG2表达影响。结果1、通过大剂量阿霉素的诱导作用,人骨肉瘤耐药株MG63/ADM被成功建立起来。MTT检测MG63/ADM细胞对ADM的耐药指数(RI)为11.47,明显高于MG63细胞(P<0.01),同时,MG63/ADM细胞对从未接触过的化疗药物顺铂和紫杉醇也存在交叉耐药,耐药指数分别为2.27、5.32,比骨肉瘤MG63细胞显著增高(P<0.01)。2、无血清悬浮培养中第3代细胞球细胞较第1代细胞形态规则,大小均匀,无死亡细胞及单个细胞存在；第3代细胞球细胞克隆形成能力最明显,其次是耐药细胞,而亲本细胞仅有少数细胞可形成克隆；MG63亲本细胞单细胞成球率为18.80%±2.51,MG63/ADM细胞单细胞成球率为36.15%±4.98,第3代细胞球细胞单细胞成球率为83.55%±10.39,说明第3代细胞球细胞具有较强的单细胞成球能力。ADM随药物浓度的增加可抑制第3代细胞球细胞的增殖,但是ADM的浓度却需要比较的高,第3代细胞球的IC50为(3.35±036)μg/ml,相比于MG63/ADM细胞对ADM的IC50(1.98 ±0.58)μg/ml,统计学上有明显的差异(p<0.05),说明了第3代细胞球对ADM明显耐药。激光共聚焦和Western blot检测显示第3代细胞球细胞中SOX2.Oct-4.Nanog呈高表达,说明通过悬浮培养获得的第3代细胞球细胞具有干细胞特性。3.ABCBl和ABCG2在MG63细胞中几乎没有表达,在MG63/ADM细胞中ABCBl和ABCG2有一小部分被表达出来,而在第3代细胞球细胞中ABCBl和ABCG2却是大量被表达,说明第3代细胞球细胞耐药与ABC膜转运蛋白高表达有关。片仔癀可以明显抑制耐药骨肉瘤干细胞的生长,抑制率随着片仔癀干预浓度的增加而相应增加；RT-PCR和Western blot检测结果显示,在第3代细胞球细胞中,随着片仔癀浓度的增加,ABCBl.ABCG2的基因表达呈明显的下降趋势,说明片仔癀逆转骨肉瘤MDR是通过下调ABC转运蛋白ABCBl和ABCG2的表达。结论1、通过ADM大剂量间隙作用成功诱导建立了骨肉瘤阿霉素耐药株MG63/ADM,无血清悬浮培养MG63/ADM细胞可富集耐药骨肉瘤干细胞。2、耐药骨肉瘤干细胞中高表达ABCB1、ABCG2蛋白,片仔癀可以明显抑制耐药骨肉瘤干细胞的增殖,抑带ABCB1、ABCG2蛋白的表达,逆转其耐药。