载基因脂质体制备、物理化学性质及其介导禽病毒病核酸免疫机理研究

来源 :中国科学院兰州化学物理研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangyaoxf520
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1.用逆相法、冷冻溶融法、冷冻干燥法、脂膜法四种方法制得了质粒DNA脂质体;2.用超声法制得了胆固醇衍生物DC-chol阳离子脂质体,该脂质体为球形小单层脂质体,平均粒径62±37nm,粒径范围25-200nm.用透射电镜研究了DC-chol脂质体与pSVH7质粒DNA形成复合物的结构和性能,脂质体DNA复合物形态发生一定改变,脂质体发生聚集和膜融合,不规则脂质体明显增多,有椭圆形、棒状结构脂质体,个别脂质体呈念珠状排列,观察到"指纹"状的复合物,此复合物与大多层脂质体结构不同,具有不规则性;脂质DNA复合物粒径分散,平均粒径增加,其大小与DC-chol脂质体/DNA电荷之比有关,当二者之比为1:1-2.5:1时粒径变化最大,个别大的复合物粒径可达1.5μm;3.由单链阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与DOPE制得阳离子脂质体,当CTAB与DOPE在1:2摩尔比条件下形成较透明的脂质体溶液,大于或小于此比例时均不易形成稳定的脂质体,在电镜下观察均匀的球形单室脂质,平均粒径49±25nm,该脂质体悬液在4℃条件下可稳定贮存3个月,未见磷脂的沉淀或脂质体的融合;4.用荧光法研究了DC-chol阳离子脂质体与质粒DNA的作用及影响因素,结果表明质粒DNA与阳离子脂质体主要是靠静电结合,要使DNA的每个磷酸基完全被脂质体结构,至少需要约5.5个左右的DC-chol分子,即需要脂质体过量.质粒DNA与阳离子脂质体结合是一个快速过程,整个反应在一分钟内完成,中性脂质体与质粒DNA只发生微弱的作用;5.用电子顺磁共振自旋标记技术研究了质粒DNA与DC-chol阳离子脂质体的作用;6.将含禽流感病毒H7亚型血凝素基因的重组质粒pSVH7(核酸疫苗)用DC-chol阳离子脂质体和胆固醇/孵磷脂/十八胺脂质体包裹,免疫2周龄SPE鸡,4周后用同型禽流感病毒进行人工感染,1周后采集泄殖腔分泌物分离病毒,结果未免疫组6/6分离到病毒,裸质粒DNA免疫组1/6分离到病毒,胆固醇/卵磷脂/十八胺脂质体包裹DNA免疫组1/6分离到病毒,DC-chol脂质体DNA免疫组没有分离到病毒(0/6);人工感染后1周各组的HI抗体(Log2)分别为6.38±0.98,7.00±1.26,7.83±1.17,8.00±0.89,2周后为8.50±0.55,8.67±0.82,8.68±0.45,9.33±0.52,脂质体包裹组在同期均高于未免疫组和裸DNA免疫组,表明脂质体包裹质粒DNA免疫动物后,能增加动物对病毒感染的抵抗力和反应能力;7.用DC-Chol/DOPE、CTAB/DOPE和PC/Chol/SA脂质体包裹新城疫病毒血凝素毒神经经氨酸酶(HN)基因的真核表达质粒pcHNM(核酸疫苗)免疫5周龄仔鸡.表明质粒DNA被脂质体包裹后,不仅增加了动物的特异性抗体产生能力,而且增加了动物对新城疫强毒的抵抗力,而且新型阳离子脂质体DC-chol/DPOE、CTAB/DOPE比天然磷脂脂质体更有效.
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