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天冬氨酸激酶(Aspartate Kinase,AK)是催化合成天冬氨酸家族氨基酸途径中的首个关键别构酶,受到代谢产物Thr与Lys的协同反馈抑制,以致该合成途径中下游产物难以大量积累。本研究旨在利用定点饱和突变提高AK酶活力并解除反馈抑制。在获得北京棒杆菌单体天冬氨酸激酶(Cp AK)并分析其结构的基础上,选取ATP周围的关键残基位点并对其进行定点饱和突变,利用高通量筛选技术选取酶活力提高的突变株,对野生型和突变体AK进行酶促动力学研究和酶学性质表征。研究结果如下:1.突变位点筛选。通过同源序列比对和Cp AK模型分析,选取Tyr198、Asp201、Val276和Thr278作为突变位点,对其进行定点饱和突变以获得酶活力提高的突变株。2.突变株构建。对所选的突变位点进行定点饱和突变,利用高通量筛选获得7株单突变株,分别为Y198N、Y198D、D201M、D201R、V276L、V276A、T278K,在单突变体和实验室前期获得的三突变体基础上,构建双突变体Y198N/D201M、Y198N/D201R(简称MN、RN)、和四突变体T379N/A380C/G171I/Y198N、T379N/A380C/G171I/D201M(简称NCIN、NCIM),经SDS-PAGE和Western blot验证,各突变株均在大肠杆菌中成功表达。3.酶促动力学分析。7株单突变株的酶活力均提高,相较于野生型AK(WT AK)分别提高15.25、11.11、13.55、12.81、6.46、3.29、7.06倍,只有V276A Km值增大,其他突变株Km值均减小,说明与底物亲和力增强。双突变株MN和RN的酶活力较野生型提高18.26和16.08倍,其中RN Km值增大。四突变株NCIN和NCIM酶活力与野生型相比分别提高75.64和68.50倍,Km值均减小,说明与底物亲和力增强,所有的突变体希尔系数n值均减小,正协同效应减弱,表明酶与底物结合后与抑制剂的亲和力减弱。4.酶学性质分析。WT AK最适温度为25℃,最适p H为8,半衰期为4.6 h,单突变株Y198N、Y198D、D201M、D201R、V276L、V276A、T278K的最适温度分别为26℃、28℃、25℃、26℃、26℃、25℃、28℃,其中Y198D和T278K的最适温度较野生型提高3℃。T278K的最适p H为7.5,有利于菌株发酵生产,Y198D的最适p H为8.5,其余突变株最适p H均为8,与野生型相同。半衰期分别为4.6 h、3.8 h、4.1 h、3.2 h、4.3 h、5 h、5.5 h,V276L和T278K的半衰期与野生型相比显著延长。双突变株MN、RN和四突变株NCIN、NCIM最适温度为28℃、26℃、25℃、26℃,MN耐高温性能增强,MN和NCIM最适p H为7.5,酶耐受p H范围变广,半衰期分别为5.3 h、5.9 h、3.9 h和4.2 h,其中MN和RN的半衰期分别延长0.7和1.3 h。除V276A外,所有突变株在不同浓度抑制剂存在条件下酶活力有不同程度的提高,抑制作用减弱,甚至在不同浓度抑制剂存在时表现出激活作用。特别是四突变体在不同浓度Lys存在条件下,抑制作用完全被解除,10 mmol/L Lys+Thr+Met条件下,四突变体NCIN的酶活力可达140.62mmol/L,NCIM的酶活力达142.20 mmol/L。5.突变位点空间结构分析。198位点突变为Asn198和Asp198后与ATP之间的氢键数量增加,201位点突变为Met201和Arg201后与ATP之间的作用力增强,同时二者的距离缩短,276位点突变为Ala276和Leu276后蛋白的静电势增大,278位点突变为Lys278后侧链增长,与周围残基Leu412和Ala416的作用力增强稳定了ATP结合,有利于催化反应的进行,进而使酶活力提高。