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β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase,β-1,4-GT)是一种Ⅱ型膜结合糖蛋白,通常认为是一种管家基因产物,是至今研究最多的糖基转移酶之一。β-1,4-GT利用尿苷二磷酸半乳糖(UDP-galactose,UDP-Gal)作为激活的糖供体,把半乳糖转移到N-多糖复合物末端的N-乙酰基葡萄糖胺上。它不仅存在高尔基体上,而且整合于细胞质膜上,并表现不同的生物学功能。 巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间和胞内型蛋白质。该系统具有细胞繁殖快、培养条件廉价、遗传操作简单、易于工业化生产等原核表达系统的特点,又具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力,避免了包涵体变性、复性,及复性后产物活性低甚至无生物学活性等问题,非常有利于真核基因的表达。 本文采用降落PCR技术,以含有β-1,4-GT基因的pGEX-4T-2质粒为模板对β-1,4-GT基因进行克隆改造,测定了克隆获得的DNA片段,与已知的基因序列一致。将克隆获得基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和Not Ⅰ之间,构建了重组分泌表达质粒pPIC9K-GT。应用电穿孔法将线性化的重组表达质粒转入宿主感受态细胞GS115,经筛选获得β-1,4-GT多拷贝整合酵母工程菌Pochia pastoris GS115。在0.5%(v/v)甲醇诱导下,工程菌Pochia pastoris GS115成功分泌了β-1,4-GT。将SDS-PAGE蛋白电泳进行密度扫描,显示β-1,4-GT占总分泌蛋白的35%。用Sephadex G-75凝胶过滤来纯化分泌蛋白,最终得率为92mg/L。将在1分钟内能转化1nmol底物所需的酶量定义为一个酶活力单位。利用苯酚红会随H~+浓度改变在557nm光密度值变化的特点,测定β-1,4-GT的酶活为98.6U,酶的比活力为21.43U/mg。同时对胞外分泌和胞内蛋白的酶活进行了比较。 我们的研究为日后对β-1,4-GT进行更广泛深入的研究,以及工业化生产有活性的β-1,4-GT奠定了基础。