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鲢(Hypophthalmichthys molitrix)是我国主要的淡水养殖鱼类之一,其养殖模式和养殖技术已经完全成熟,但是鲢对低氧环境比较敏感且耐受程度低,易发生大面积的泛塘现象。本文以鲢为研究对象,开展了其细胞周期蛋白(Cyclin)相关基因(Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D和Cyclin E)、细胞周期检测点激酶(Chk1)和细胞周期分裂素基因(Cdc25A)的克隆、组织表达以及低氧胁迫过程中这几个细胞周期相关基因在鲢脑、肝脏、鳃三个与呼吸相关的组织器官中的表达分析。同时我们通过流式细胞分析法以及TUNEL法检测低氧诱导下鲢肝、脑细胞凋亡情况。实验结果如下:1.鲢细胞周期相关基因的克隆及低氧胁迫下的表达分析根据Gen Bank中斑马鱼的细胞周期相关基因序列对保守区引物进行设计,采用同源克隆和RACE技术获得了鲢Cyclin A、Cyclin B和Cyclin E全长序列,并扩增Cyclin D、Chk1和Cdc25A基因的核心片段。Cyclin A基因全长1654bp,5’非编码区73bp,3’非编码区396bp,最大开放阅读框1185bp,编码394个氨基酸;Cyclin B基因全长1523bp,5?非编码区77bp,3‘端252bp,最大开放阅读框1194bp,编码397个氨基酸;Cyclin E基因全长1881bp,5’非编码区212bp,3’非编码区430bp,最大开放阅读框1239bp,编码412个氨基酸。氨基酸序列同源一致性比对结果显示,鲢Cyclin A和Cyclin B基因与鲤鱼的这两个基因氨基酸序列同源一致性最高,分别是99%和100%,Cyclin E基因与斑马鱼的Cyclin E基因氨基酸序列同源一致性最高为99%。半定量RT-PCR检测结果显示,Cyclin A基因在肝和脑中表达量较高,在鳃中表达量较低;Cyclin B基因在心脏中表达量较高,在其他的组织中表达量较低;Cyclin D基因在肝、脑、肾和心脏中的表达量比较高,在其他组织中的表达比量较低;Cyclin E基因在肌肉、脑和肝中表达量较高,在其他组织中表达量较低;Chk1基因在肝和脑中表达量较高,在脾中不表达,在其他组织中表达量较低;Cdc25A基因在心脏、脑、肝中表达量较高,在鳃中表达量较低,在其他组织中不表达。Real-time PCR检测结果显示,鲢由正常情况下低氧胁迫至浮头再到死亡的过程中,在肝脏中,Cyclin A和Cyclin E基因表达量逐渐下降(P<0.05);Cyclin B和Cyclin D基因表达量无明显变化(P>0.05);Chk1基因表达量先升高然后下降(P<0.05);Cdc25A基因表达量先下降后升高(P<0.05)。在脑中,Cyclin A和Cdc25A基因表达量先下降然后上升(P<0.05);Cyclin B和Cyclin D基因表达量无明显变化(P>0.05);Cyclin E基因表达量呈现下降趋势(P<0.05);Chk1基因表达量先升高然后下降(P<0.05);在鳃脏中,Cyclin A和Cyclin E基因表达量逐渐下降(P<0.05);Cyclin B和Cyclin D基因表达量无明显变化(P>0.05);Chk1基因表达量先升高然后下降(P<0.05);Cdc25A基因表达量先下降后升高(P<0.05)。本研究中结果显示四个细胞周期蛋白基因Cyclin A、Cyclin E、细胞周期检测点激酶Chk1和细胞周期分裂素基因Cdc25A的表达受低氧应激的调节。2.Annexin V/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测低氧诱导下鲢肝、脑细胞凋亡情况本实验通过Annexin V/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测低氧胁迫下鲢肝、脑细胞的凋亡情况。Annexin V/PI流式细胞仪分析,在肝脏中细胞凋亡率依次是对照组8.85±0.24、浮头期22.06±0.57、死亡期22.91±0.49;在脑中细胞凋亡率依次是对照组8.18±0.45、浮头期24.80±0.63、死亡期24.86±0.21。TUNEL法检测显示,在肝脏中细胞凋亡率是对照组3.80±0.16、浮头期36.78±0.34、死亡期37.27±0.35;在脑中细胞凋亡率依次是对照组6.74±0.30、浮头期35.04±0.40、死亡期35.71±0.41。结果表明与正常对照组比较,低氧胁迫后鲢肝、脑细胞凋亡显著增加,但在死亡时期凋亡细胞数目却没有明显差异。