人类乳头瘤状病毒(Human papillomavirus, HPV)感染是宫颈癌的主要危险因子,近年来分子流行病学发现,HPV感染与口腔鳞癌的发生也有着密切的关系,HPV作为一个独立的危险因子,与口咽癌和口腔癌密切相关。25%的HNSCC可检测到HPV的DNA,尤其是HPV16,90%的HPV相关头颈部肿瘤由HPV16引起。但是HPV在不同地区的检出率及检出型别报道不一,本课题首先对HPV在武汉地区的OSCC患者中的发生率进行了流行病学的调查。另外,尽管目前有预防性疫苗和各种筛查措施来预防HPV的感染,但HPV引起的疾病在全球依然很普遍,全球有三分之一的感染性肿瘤是由HPV引起。很多研究都证明业已存在的HPV预防性疫苗对尚未感染过该病毒的人群有很好的预防作用,但是不能清除已经存在的病毒感染,因此,HPV治疗性疫苗的发展对治疗HPV相关肿瘤有着重大意义。本研究包含三个部分：第一部分：HPV在武汉地区的口腔癌患者中的流行病学调查收集从2009到2013年间诊断为OSCC的病例标本以及健康人群的第三磨牙拔除术中的牙龈组织,样本收集后立即储存于-80℃冰箱备用。用Qiagen试剂盒提取新鲜／冰冻组织中的总DNA,选取HPV通用引物GP5+/GP6+(5’-TTTGTTACTGTG GTAGATACYAC-3’/5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’),进行PCR分析,阳性结果送往生工测序鉴定HPV型别。SPSS20.0软件分析统计结果。结果显示OSCC组的HPV感染率达到27.5%,而对照组的HPV感染率是2.9%。第二部分：HPV治疗性疫苗的构建与检测1、HPV疫苗的构建为了降低HPV的转化活性,HPV16E7的第24位、26位和91位氨基酸C24E26和C91修改为了甘氨酸,HPV16E6的第63位和106为氨基酸C63和C106也修改为甘氨酸以破坏原有的锌指结构。把E7E6的基因序列直接连接,然后用人缘化密码子优化,得到的融合蛋白的基因序列在Invitrogen公司合成,并克隆大pVAX1载体上,命名为pE7E6。然后E7E6基因片段通过两端的KpnI和NotI酶切位点克隆到防龋疫苗pGJAP/VAX1上,得到带有靶向序列CTLA-4的疫苗pCTLA4-E7E6。同样,未经过修改的对照质粒疫苗命名为pwCTLA4-E7E6和pwE7E6,为了增强对照,未经修改过氨基酸序列的野生型E7和野生型E6也分别克隆到载体pVAX1上得到pwE7和pwE6。所有质粒都经DNA测序鉴定其正确性。结论：靶向HPV疫苗pCTLA4-E7E6及非靶向对照疫苗pE7E6、野生型对照疫苗pwCTLA4-E7E6、 pwE7E6、pE7、pE6成功构建。2、HPV疫苗的性能及机制检测构建好的疫苗以对照疫苗分别用Lipofectamine转染试剂转染293细胞,48h后提取表达的蛋白,分别检测E7、E6、p53、Rb等蛋白的表达。同时,用ELISA试验检测转染上清中的蛋白浓度,然后用流式细胞术检测融合蛋白结合DC2.4细胞系的能力。结论：新构建的融合CTLA-4及E7E6优化序列的质粒DNA,在体外细胞内能够正确表达相关蛋白,并且与p53、Rb等抑癌因子的结合力下降,无致癌危险。体外培养细胞上清中分泌的融合蛋白能够结合到DC2.4细胞系,证实其靶向性作用机制。第三部分：HPV治疗性疫苗在小鼠体内外的实验研究质粒pCTLA4-E7E6、pE7E6、pVAX1经真空干燥后重新溶解到生理盐水中以得到DNA的终浓度为1μg/μl.1、治疗性免疫选用6-8周龄的C57BL/6小鼠30只,随机分成4组：pCTLA4-E7E6、pE7E6、 pVAX1和PBS组。每只小鼠皮下注射2×105个TC-1细胞,在第10天的时候给予第一次免疫,免疫组小鼠在左后腿肌肉内注射100μL质粒,对照组注射100μLpVAX1或PBS。所有小鼠在第17天接受第二次免疫。每周记录肿瘤大小2-3次。第0、24、38天的时候收集小鼠上清做ELISA实验,分析小鼠体内抗体水平。在第38天,取脾细胞做CTL分析。结论：pCTLA4-E7E6诱导了比pE7E6更强的治疗性免疫效果。2、预防性免疫6-8周龄的C57BL/6小鼠32只随机分成4组：pCTLA4-E7E6、pE7E6、pVAX1和PBS组。在第0、14天进行免疫,第28天,每只小鼠注射6×104个TC-1细胞,第0、14、28、60天的时候收集小鼠上清做ELISA实验,分析小鼠体内抗体水平。在第80天,取脾细胞做CTL分析。结论：pCTLA4-E7E6诱导了比pE7E6更强的预防性免疫效果。