对虾血细胞T7噬菌体展示文库构建及功能基因淘选

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随着现代集约化高密度养殖及养殖规模的扩大,对虾疾病的发生日益频繁和严重。由于目前对对虾免疫防御机制研究的不是很深入,所以对于某些疾病的预防和治疗缺乏有效的措施,给我国对虾养殖业造成了巨大的经济损失。本实验室一直从事对虾免疫相关的研究,为了研究对虾的免疫相关基因及免疫机制,例如:模式识别受体等,本论文应用T7噬菌体展示这种成熟、有效的研究技术,构建了中国对虾血细胞T7噬菌体展示文库,并且使用多种配体和方法进行文库的生物淘选,对获知的有研究价值的基因进行基因克隆和表达的研究。该研究可以为了解对虾免疫机制提供基础资料。主要的研究工作和结果包括: 1.以细菌刺激后提取的对虾血细胞mRNA为材料,构建中国对虾血细胞的T7噬菌体展示文库,并且进行文库扩增,扩增后文库的滴度达到1011pfu/ml。 2.选择不同的配体,包括革兰氏阴性菌细胞、革兰氏阳性菌细胞、脂多糖和几丁质,应用不同的方法进行淘选,淘选3轮后随机挑取数个噬菌斑,用载体引物扩增插入片断,将不同长度的片断克隆入pMD 18-T载体进行测序,测序结果进行blast比对分析,获得16个可信度较高的基因片段,包括围食膜蛋白、蛋白质精氨酸N甲基转移酶、钙网蛋白、RNA结合蛋白、核自身免疫精蛋白等,多数基因在对虾中尚没有报道。 3.对用藤黄微球菌为靶标淘选得到的RNA结合蛋白基因进行深入的研究:包括全长基因克隆、用RT—PCR、Northern blot和原位杂交的方法研究该基因在对虾不同组织的表达和分布。结果显示此基因在卵巢中的表达量最高,在刺激后的血细胞、心脏、肝脏、肠等多个组织中此基因的表达上调。 4.用脂多糖为配体淘选得到延伸因子1-α基因片段,克隆此基因的全长,应用RT—PCR和原位杂交,结果证明此基因在刺激后的肝脏、胃和肠的表达高于未刺激的组织中的表达。推测该基因可能与免疫防御有关。
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