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目的:肥胖作为多种慢性病的诱因,已被列为疾病发生的六大危险因素之一。每年全世界至少有300万人死于肥胖相关疾病。控制肥胖和超重形势刻不容缓。肥胖与骨骼肌的状态密切相关。骨骼肌细胞可氧化利用体内游离的脂肪酸,减少脂肪细胞的堆积从而控制肥胖,这个过程主要是通过调节骨骼肌细胞线粒体的大小数目和相关肌肉因子的分泌。Irisin是由骨骼肌细胞分泌的一种细胞因子,当骨骼肌的Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白 5(Type Ⅲ domain-containing protein5,FNDC5)被剪切成小分子多肽 Irisin并释放入血液循环系统后,可靶向作用于白色脂肪组织,使其棕色化产生热能而发挥抗肥胖的作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC-1α)是 FNDC5 的上游调控蛋白,PGC-1α水平增加能促进骨骼肌Irisin/FNDC5的表达。前期研究发现补肾方二仙汤可改善白色脂肪的内分泌功能,提高产热相关蛋白解偶联蛋白-1(Uncouplingprotein 1,UCP-1)的表达,最终达到干预更年期肥胖的目的。同时也发现二仙汤君药淫羊藿的主要成分淫羊藿苷可促进棕色脂肪产热蛋白表达。AMPK(Adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase)是 AMP 所依赖的蛋白激酶,是机体调节能量代谢与平衡的关键因子,与糖脂代谢密切联系。我们发现二仙汤在促进棕色脂肪产热蛋白表达的同时也激活了 AMPK通路。本论文将在前期研究的基础上探究淫羊藿苷对骨骼肌Irisin/FNDC5的影响及其机制,并探究AMPK通路在这一过程中可能的作用机制。本文对Irisin分泌的研究,可为临床上肥胖的防治提供新思路。方法:1.细胞水平下研究淫羊蕾苷对骨骼肌细胞Irisin/FNDC5及AMPK磷酸化的影响C2C12成肌细胞经马血清干预分化为骨骼肌细胞,分别设立浓度梯度分组:空白对照组(CON,0μgg/mL)、淫羊蕾苷低剂量组(ICAL,20μg/mL)、淫羊藿苷中剂量组(ICAM,40μg/mL)、淫羊蕾苷高剂量组(ICAH,80μg/mL),作用骨骼肌细胞24h;时间梯度分组:淫羊藿苷中剂量组(ICAM)分别作用骨骼肌细胞0h、12h、24h、48h。(1)运用CCK-8法检测不同浓度梯度和时间梯度的细胞生存率;运用ELISA技术检测不同浓度梯度淫羊藿苷作用骨骼肌细胞24h后细胞上清液中Irisin的含量;(2)应用Westerm-blot及荧光定量PCR技术检测不同浓度梯度和时间梯度细胞Irisin上游因子(FNDC5,PGC-1α)的蛋白及mRNA水平;(3)应用免疫荧光技术检测淫羊藿苷对骨骼肌细胞FNDC5的蛋白表达水平;(4)加药作用15min后,Western-blot检测AMPK及p-AMPK的蛋白表达,使用AMPK阻断剂Compound C(50μM,预处理1h后更换为含40μg/mL淫羊藿苷细胞培养液继续培养24h)及激动剂AICAR(0.1mM)干预骨骼肌细胞,应用Westem-blot及荧光定量PCR技术检测FNDC5的蛋白及mRNA水平;(5)骨骼肌细胞进行siRNA转染干扰AMPK,应用Westerm-blot检测FNDC5的蛋白表达。2.在整体水平研究淫羊藿苷对C57BL/6小鼠骨骼肌分泌Irisin及AMPK磷酸化的影响C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(CON,等量生理盐水灌胃)、淫羊藿苷低剂量组(ICAL,10mg/kg)、淫羊蕾苷高剂量组(ICAH,40mg/kg),分别给予相应的药液连续灌胃14天,检测各组小鼠体质量变化。器官水平下,取各组小鼠腓肠肌组织,应用Westem-blot及荧光定量PCR技术检测FNDC5、PGC-1α的蛋白及mRNA水平;Westem-blot检测AMPK及p-AMPK的蛋白表达;应用免疫组化技术检测各组小鼠腹股沟皮下脂肪产热蛋白UCP-1的表达量。结果:1.淫羊藿苷作用骨骼肌细胞后,细胞上清液中Irisin的分泌水平明显高于空白组(P<0.05);Westem-blot及荧光定量PCR结果显示与空白组相比,低、中、高剂量淫羊藿苷组细胞FNDC5和PGC-1α的蛋白及mRNA水平提高,且呈时间-浓度依赖性(P<0.05);Westem-blot结果表明同空白组相比,淫羊蕾苷干预组中细胞AMPK的磷酸化水平明显提高(P<0.05);分别用AMPK激动剂AICAR和抑制剂Compound C抑制AMPK表达作用骨骼肌细胞及siRNA干扰AMPK检测FNDC5的表达水平,Westem-blot结果显示当AMPK通路激活后,FNDC5的表达上升,当AMPK磷酸化水平下降后,FNDC5的蛋白表达水平下调(P<0.05)。差异均具有统计学意义。2.淫羊蕾苷灌胃C57BL/6小鼠14天后,高剂量淫羊藿苷干预组的体质量增加与空白组相比明显下降(P<0.05);Westem-blot及荧光定量PCR结果显示与空白组相比,淫羊藿苷干预组中小鼠腓肠肌FNDC5和PGC-1α的蛋白及mRNA水平显著提高(P<0.05),AMPK的磷酸化水平提高(P<0.05);免疫组化结果显示腹股沟皮下脂肪产热因子UCP-1的表达量与空白组对比明显提高(P<0.05)。差异均具有统计学意义。结论:1.淫羊藿苷可通过激活AMPK通路,促进骨骼肌细胞Irisin/FNDC5和PGC-1α的表达。2.淫羊藿苷可激活AMPK通路,促进小鼠骨骼肌Irisin/FNDC5的表达,增强白色脂肪棕色化,降低小鼠的体质量增加,发挥抗肥胖的作用。