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稀有糖因其具备许多特殊功能,备受国内外研究者的关注。生物酶法制备稀有糖具有高选择性、副产物少且环境友好等优点,但是筛选高效转化制备稀有糖的酶不容易,通过解析酶的三级结构确定重要催化位点并合理设计定向进化突变的分子改造酶工程是目前改善酶催化效率的有效方法之一。在国内外和本课题组研究的基础上,本文旨在通过定点突变等策略对来自苍白杆菌CSL1（Ochrobactrum sp.CSL1）核糖-5-磷酸异构酶（RpiA）进行分子改造,从而改良其酶学性质,优化RpiA制备稀有糖的催化过程,主要研究内容如下:首先,将构建于大肠杆菌BL21（E.coli BL21）工程菌的OsRpiA基因进行序列测定与分析,发现OsRpiA整段序列是由233个氨基酸构成,与不同来源的RpiA进行多序列比对分析,结合OsRpiA酶的结构模型定位该酶的重要氨基酸残基;通过同源建模构建出突变株的结构模型,并将其与底物分子对接,通过丙氨酸扫描实验（如S31A、D84A、D87A、K87A、E106A、K124A）研究重要氨基酸位点确定突变后的影响,分别以L-核糖、D-阿洛糖、L-鼠李糖为底物,探究丙氨酸突变体催化效率的区别,突变对D-阿洛糖的催化表现为K124A酶活提高至140%。之后对OsRpiA的底物谱进行初步探索,包括L-核糖、D-核糖、D-核酮糖、D-阿洛糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-阿拉伯糖,计算得出不同底物之间的相对酶活,通过分子对接将野生型与底物进行对接分析解释相对酶活之间的差异性,发现在分子水平野生型OsRpiA可以较好的与L-核糖、D-核糖、D-核酮糖进行对接,内部的关键催化氨基酸E106与配体的基团距离相近,而D-阿洛糖、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖也可以勉强在分子水平上对接,与D-木糖对接结果为E106与配体的C1距离较远为7.5?,超出了氢键结合距离。其次,基于上述OsRpiA底物谱与丙氨酸突变体结果,对OsRpiA重要催化位点进行设计,得到了S31G、S31T、S31R、S31H、S31D、D87W、D87P、D87Q、D87T、D87L、D87H突变体;并对酶活提高最明显的K124进行饱和突变,得到K124G、K124M、K124V、K124I、K124L、K124A、K124R、K124S、K124P、K124T、K124Q、K124C、K124N、K124H突变库,与突变前相比,有十株突变体对D-阿洛糖酶活表现为负影响,而K124A酶活提升达145%,K124L、K124S、K124C等三个突变体酶活分别提高20%、15%、15%,酶活提高的丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸均属于非极性脂肪酸氨基酸,将该位点原本亲水的极性氨基酸突变为非极性、疏水性强的氨基酸可以提高OsRpiA催化D-阿洛糖的酶活。随后,分析突变体K124A催化特性,首先通过不同p H下酶活区别发现K124A最适p H由p H 7.5降低到p H 7.0,表明酶在温和的条件下达到最佳催化效果;其次通过不同温度下K124A反应最佳温度为45℃,进一步研究酶热稳定性半衰期的变化,低温下突变体酶的热稳定性更好;酶的反应进程结果表明K124A对比野生型OsRpiA催化D-阿洛糖的最大转化率提高至140%。动力学分析表明K124A的Km降低了12%,对D-阿洛糖催化效率（kcat/Km）提高了65%。此外,分子动力学模拟（MD）也表明底物和K124A结合比野生型更稳定,K124A催化残基E106与D-阿洛糖之间距离更短且键角更松弛。这项研究突出了OsRpiA作为制备稀有糖的生物催化剂的潜力,并为其催化机理提供了证据。最后,在改造完OsRpiA重要位点的基础上,通过对OsRpiA结构中位于环上的氨基酸进行改造,设计并定点突变得到了G28H、T29A、G30D、A33C、T55Q、G85S、A86D、A86S、K97A、G98K、A120N、A102E、G100D、G100K、G101D、G101N以及位于磷酸识别位点的突变株S31T、S31R、T32Q、T32S和被设计来改善酶的热稳定性A10T突变库,以期提高OsRpiA催化L-核糖、D-核糖的催化酶活。随后进行了迭代突变,获得了六株突变体A10T/T32S/G101N、A10T/A102E、A10T/T32S、A10T/T32Q、T32Q/100D、T32Q/G98K。以L-核糖为底物,筛选得到了对L-核糖活性提高1.6倍的突变体A10T/T32S/G101N。并获得了一株更有更高热稳定性的突变株A10T,分析原因可能是其突变后的残基与邻近β折叠上的氨基酸侧链形成了稳定结构。T32S在催化D-核酮糖时的效率提高了93%,最后通过分析突变体与底物分子对接结果,比较底物与酶结构中的关键氨基酸E106的分子距离,结果为T32S具有比野生型更好的空间对接形态。本文的研究结果有利于更好地解释RpiA关键残基的复杂功能,对分析其催化机理具有指导作用,对进一步将OsRpiA应用于稀有糖制备具有重要的意义。