论文部分内容阅读
冠心病是严重危害人类健康的主要心血管疾病之一，近二、三十年来，随着冠状动脉造影、冠状动脉成形术（percutaneous transluminal coronaryangioplasty，PTCA）和冠状动脉—主动脉旁路移植术（coronary aorta bypassgraft，CABG）等新技术的开展，大多数冠心病患者得到了积极的诊治，但冠心病PTCA晚期再狭窄发生率在30％—50％，CABG移植血管的通畅率亦随术后时间延长而递减，心肌缺血仍是难以解决的问题。能否寻找一种新的治疗方法以防止血管成形术（PTA）后再狭窄，并可促进缺血心肌“分子搭桥”?本研究通过一种重要的促血管生长因子—血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）的基因治疗，观察其对血管成形术（percutaneoustransluminal angioplasty，PTA）后再狭窄的防治作用，以及在缺血心肌侧枝循环建立中的作用，寻找冠心病治疗的新途径。 本实验分为三部分工作，现概述如下： （一）hVEGF165真核表达载体的构建及表达产物的活性检测。 将已获得的hVEGF165cDNA克隆到pcDNA3构建真核表达载体，通过酶切鉴定和DNA测序挑选正向插入的pcDNA3／hVEGF165，脂质体介导转染中国仓鼠卵巢细胞Kl亚株（CHO—K1），经过G-418抗性筛选，挑选出转染阳性细胞克隆，G-418维持培养，提取细胞总RNA，以三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照进行Northern Blot分析，培养液上清行Western Blot分析，心肌血管内皮细胞（myocardial endothelial cell，MEC）原代培养加入pcDNA3／hVEGF165阳性细胞培养液，采用[3H]-TdR掺入法检测表达蛋白的活性。结果：1．BamHl酶切鉴定：酶切后琼脂糖凝胶电泳结果显示hVEGF165cDNA片段大小约600bp。2．测序鉴定：经DNA测序，该cDNA在起始密码（ATG）后第33位碱基发生了T-C突变，但突变前后密码子编码的是同一个氨基酸Leu，属无义突变，其余氨基酸序列与国外报道的完全一致。3．Northern Blot分析：32P标记hVEGF165探针的Northern Blot结果显示，实验组（pcDNA3/hVEGF165组）在18S和28S之间出现一条约1000base的特异性条带，而对照组（pcDNA3组）无任何阳性信号出现。4．Western Blot分析：hVEGF165抗体的Western Blot结果显示，实验组细胞培养液样品出现明显的染色条带，而对照组则无明显条带。5．重组hVEGF165的活 绍二军医大学 地士学位论义 性检测：们—TdR掺入法检测发现，当加入 PCDNA／ hVEGF；。。转染阳性细胞培养 上清浓缩液0．78八2．5UI时，实验组MEC的掺入率明显高于对照组，其中加入 6．25ul培养液的刺激活性最高，为对照组的198．8％，说明获得的表达蛋白比活 性较高。结论：PCDNA。是较理想的真核表达载体，在绝大部分哺乳动物细胞能 够表达，其表达具有拷贝数高和稳定性好的特点，本实验将hVBG、沪ONA构建 到PCDNA。中获得成功。同时，通过对PCDNA。／hVEGF；。。在哺乳动物细胞中的转 录和表达的检测，证实其能转染真核细胞，获得的表达蛋白比活性较高，提示 本载体可作为基因治疗药物用于哺乳动物的实验研究。 （二）hyEG；。对颈总动脉球囊损伤后血管内皮细胞的修复和再狭窄的防治作 用 将 16只新西兰大白兔随机分为治疗和对照两组，每组又依观察时间分为 ZW 亚组和 44亚组，治疗组予 500ug pcDNA。／hVEGF；。。质粒治疗，对照组予等量 ncDNA。 质粒治疗。在兔颈总动脉实施PTA后即刻，治疗组和对照组分别经扩张导管在 损伤的局部动脉腔内给药，给药处的两端用动脉夹阻断颈总、颈内动脉血流， 结扎颈外动脉；’30分钟后去除动脉夹，恢复血流。给药后ZW、4W行颈总动脉 血管造影，观察 PTA后血管再狭窄情况，而后取 Icm损伤的动脉段置于 10％中 性福尔马林液内固定，常规石蜡包埋，制成4urn厚连续切片，分别做HE、P八B 和Vlll相关抗原染色，以观察内皮细胞的修复速度，管腔狭窄程度和新生内膜 增殖情况，另取k 动脉段液氮保存做Northern Blot分析。结果：1．颈总动 脉血管造影所见：给药后第ZW、4W，hVEGF；。。治疗组血管直径狭窄均较对照组 明显减轻：治疗组给乙酚胆硷（ACh）和硝酸甘油（NG）后损伤的颈总动脉均 明显扩张，而对照组给ACh后血管收缩，给NG后血管扩张。2．病理染色所见： HE染色横切面显示治疗组 ZW、4W管腔平均狭窄分别为 9．SS％和抢 ．09％，而对 照组 ZW、4W管腔平均狭窄分别为 31．72％和 44．05％，治疗组较对照组管腔狭窄 程度明显减轻（P＜0．01）。P／VB染色纵切面显示治疗组内膜增生程度（内膜／中 膜，I川）ZW和 4W分别为 0．39和 0．76，而对照组内膜增生程度 ZW和 4W分别 为0．82和l．62，治疗组较对照组内膜增生程度明显减轻（P＜0．05）。3．免