亲和层析具有特异性强、高效、操作简单等多种优势,是纯化生物酶的首选方法。荞麦胰蛋白酶抑制剂（Buckwheat trypsin inhibitor,BTI）是一种胰蛋白酶的竞争型抑制剂。BTI良好的热稳定性和酸碱稳定性及对胰蛋白酶较强的抑制作用能满足亲和材料制备对配基的要求,因而能够用于制备亲和层析介质,实现一步层析得到高纯度胰蛋白酶的目的,为今后大规模制备胰蛋白酶及开发新型胰蛋白酶提供重要的理论依据。第一部分:基于抑制剂与酶的特异亲和作用,将具有良好稳定性的BTI固定化,制备成一种新型胰蛋白酶的亲和材料,用于胰蛋白酶的高效纯化。通过原核表达、Ni²⁺-NTA亲和层析和Superdex G-25凝胶过滤层析等方法获得电泳纯的重组BTI。以Sepharose为载体,BTI为配基,比较三种活化载体方法（溴化氢,环氧氯丙烷,羰基二咪唑）,选出制备BTI-Sephorose亲和材料的最优活化方法。结果表明,BTI的耐热性、良好的酸碱稳定性和对胰蛋白酶的专一性抑制满足了亲和材料制备对配基的要求。羰基二咪唑是一种比较理想的活化剂,可为亲和层析固定化其他酶提供参考。第二部分:以牛胰蛋白酶为材料,检测BTI-Sepharose对胰蛋白酶的特异性吸附作用,并进一步研究BTI-Sepharose对胰蛋白酶吸附及解吸附的条件。结果表明,制备的BTI-Sepharose对胰蛋白酶具有特异吸附性,可用于胰蛋白酶的亲和纯化。缓冲液pH值对BTI-琼脂糖凝胶与胰蛋白酶的吸附及解吸附均有重要影响,二者吸附作用的最适pH值为7-8,在pH值为3.5时两者能够完全分离,且不影响胰蛋白酶的生物活性。本实验制备的BTI-琼脂糖凝胶可实现一步层析制备高纯度胰蛋白酶,为胰蛋白酶的高效纯化及新型胰蛋白酶的研究开发提供了理论依据。第三部分:从草鱼肝胰腺中提取胰蛋白酶,经匀浆,硫酸铵沉淀,透析获得胰蛋白酶粗酶液,再通过BTI-Sepharose亲和层析一步纯化得到电泳纯的草鱼胰蛋白酶,并进一步研究了该胰蛋白酶分子质量及酶学性质。结果表明:草鱼胰蛋白酶的分子质量约为27 kDa,米氏常数K_m为3.4×10^-5 mol/L;最适反应温度为60℃,在低于60℃的条件下能够保持稳定;最适pH值为9.5,酸碱耐受范围为pH 6.0-12.0;Ba²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺在0-10 mmol/L的浓度范围内对该酶具有一定程度的激活作用;K⁺和EDTA在0-10 mmol/L范围内对该酶有抑制作用,EDTA较K⁺对该酶的抑制作用更明显。