论文部分内容阅读
溴结构域（BRD）具有特别的序列与结构,是一种蛋白与蛋白相互作用的交叉模块,在1980s首次从黑腹果蝇的基因中被鉴别出来并命名。目前已被发现的61个溴结构域分别存在于46个蛋白中,根据其序列与结构的相似性与差异性,被分为8个家族。TRIM24（Tripartite motif containing 24）蛋白属于第五家族,另外TRIM24蛋白也属于TRIM家族,其家族特征是即使其成冰盒员缺少一个结构域,其它的结构域在顺序和空间方面仍具有高度保守性。TRIM24在最初阶段中被命名为TIF1α（转录调节因子1α）,属于共调节因子,在维甲酸信号通路中发挥作用,参与了细胞凋亡、周期调控等重要的生命过程。研究表明,TRIM24蛋白的过多或者过少表达会出现多重机制的功能障碍,进而促进肿瘤发生和成长。其中TRIM24与乳腺癌、肝癌、胃癌、非小细胞肺癌和前列腺癌等各种癌症的发生密切相关。而由于TRIM24的相关小分子抑制剂难以成药,目前市场上抑制剂很少,能够进行活性筛选的实验方法也很少,所以进行以TRIM24溴结构域小分子抑制剂的筛选进行研究,具有重要的研究价值和现实意义。本课题研究内容主要是研究TRIM24溴结构域小分子抑制剂活性筛选,筛选出活性相对较高的小分子抑制剂。首先,通过使用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达,再利用亲和层析、凝胶过滤层析等纯化方法得到高纯度的TRIM24目的蛋白。然后使用AlphaScreen实验方法进行活性筛选,从实验室现有的3个小分子抑制剂库中初步筛选得到16个具有优化潜力的苗头小分子,其中F8、L6、L7、L8小分子活性相对较高,IC50值分别达到5.91μM、4.73μM、5.53μM、4.77μM。在这四个小分子抑制剂的结构基础上进行结构优化改造,合成了50个小分子,其中化合物F15、L19、L27、L34活性较高,通过AlphaScreen实验数据分析,IC50值达到1μM左右。在其后进行的TSA实验上,ΔTm达到2°C左右,活性相对较好。综合AlphaScreen、TSA实验数据结果,得到4个具有活性相对较高且具有优化潜力的小分子抑制剂。经过上述实验的摸索和数据分析,选取活性较好的小分子抑制剂进行共结晶实验,研究TRIM24目的蛋白与小分子抑制剂的真实结合模式。重新纯化目的蛋白进行结晶,目的是提高结晶成功率。采取悬滴法进行晶体的培养,为了达到衍射条件,后续进行晶体优化。通过上述实验得到了小分子抑制剂L19与TRIM24目的蛋白的复合物晶体及结构。该晶体结构对研究小分子抑制剂与蛋白结合方式及小分子抑制剂的结构设计具有重要的参照意义,为TRIM24小分子抑制剂后续的发现和设计提供了理论基础和进一步研究思路。本课题以TRIM24溴结构域小分子抑制剂的筛选进行研究,通过全面的文献阅读,一系列实验设计及摸索,最后筛选得到活性相对较高的小分子抑制剂F15、L19、L27、L34。后续进行共结晶实验,得到小分子抑制剂L19与TRIM24目的蛋白复合物的结晶体,进行解析研究其真实结合模式。本课题研究为TRIM24目的蛋白相关生物结构学和小分子抑制剂的研究开发提供了一定的理论与物质基础。