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南瓜多糖是从南瓜中提取分离出来的一类具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤以及抑菌活性等功能的重要天然生物活性物质。目前对南瓜多糖的研究主要是多种组分整体多糖的活性研究，对各组分的结构、活性并未深入探讨。在降血糖方面，已有报道显示南瓜多糖对胰岛β细胞具有一定的保护作用，但对其具体的保护机制尚未明晰。因此本文通过建立体外细胞模型，对其可能的保护机制进行初步探讨。本文主要研究内容如下：
（1）南瓜多糖的提取与分离纯化
本文结合微波和超声辅助提取技术的优点，探讨超声微波辅助萃取仪提取南瓜多糖的最佳工艺条件。通过单因素实验得到南瓜多糖超声微波辅助浸提的最优条件为：料液比1:60，温度70℃，时间30min。在此最佳工艺条件下南瓜粗多糖提取得率为54.7%。对上一步超声微波辅助萃取制得的南瓜多糖粗提液，用双水相作初步的纯化。首先是探究不同系线长度（TLL）的乙醇-硫酸铵双水相体系对南瓜多糖富集纯化的影响，其次是对双水相富集得到的多糖（APTS-PP）用DEAE-纤维素-52阴离子交换树脂作进一步纯化。实验结果表明多糖主要富集于下相，色素等杂质则富集于上相，且TLL=45的乙醇硫酸铵体系对南瓜多糖具有较好的富集效果，下相多糖收率为78.34%，蛋白残留率为14.62%。Sevage法脱除蛋白后多糖得率为63%，蛋白残留率22.22%。由此可知ATPS法相较Sevage法在除蛋白方面具有一定优势。南瓜多糖粗提液经乙醇硫酸铵ATPS处理后的下相，通过DEAE纤维素-52柱层析分离可得到两种多糖组分为中性组分ATPS-PP-1、酸性组分ATPS-PP-2，多糖得率依次为39.1%、53.7%，纯度分别为89.41%、92.68%。
（2）ATPS-P-1、ATPS-PP-2的结构解析
间羟联苯法测定ATPS-PP-1、ATPS-PP-2糖醛酸含量依次为2.96%、10.73%。HLPC-ELSD测定ATPS-PP-1、ATPS-PP-2的分子量分别是7.67KD、8.83KD。高效液相色谱法测定ATPS-PP-1的单糖组成为葡萄糖，含量100%，APTS-PP-2单糖组成有葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，含量依次为8.71%、79.23%、6.57%、5.48%。通过甲基化分析和NMR技术对多糖结构进行解析，结果表明ATPS-PP-1和ATPS-PP-2的构型都为α构型，糖环都为吡喃糖环。ATPS-PP-1的糖链主要是T-Glc，(1→3)-Glc，(1→3,4)-Glc，其中以(1→3)-Glc构成多糖主链；ATPS-PP-2的糖链主要是T-Glc，(1→4)-Glc，(1→6)-Glc，(1→3)-Gal和(1→3,6)-Glc，其主链主要由(1→4)-Glc残基构成。
（3）南瓜多糖各组分对STZ诱导胰岛β细胞损伤的保护作用及机制研究
南瓜多糖的体外降糖实验表明，不同浓度的南瓜多糖对STZ损伤的胰岛β细胞，有一定的保护作用，且这种保护作用呈现一定的剂量依懒性。通过研究不同浓度的STZ对胰岛β细胞活性影响，筛选出最适的STZ损伤造模浓度为3mmol/L。通过以上实验研究发现，STZ与胰岛β细胞共同孵育后，细胞存活率下降，光镜下可见贴壁细胞出现凋亡细胞的特征：细胞皱缩、变圆、脱落，细胞群数量减少。且细胞内SOD酶活性明显下降，脂质过氧化损伤明显增加，MDA浓度升高。南瓜多糖干预损伤组后，能显著提高胰岛β细胞的SOD酶活性，降低MDA浓度。通过对比ATPS-PP-1与ATPS-PP-2对胰岛β细胞的保护效果，结果显示高浓度下（1000μg/mL）ATPS-PP-1在提高细胞存活率、SOD酶活性及降低MDA浓度方面效果优于ATPS-PP-2（P<0.05）。
观察南瓜多糖各组分对STZ损伤大鼠胰岛β细胞NO产生、NF-κB和iNOSmRNA表达的影响，进一步探讨南瓜多糖各组分保护胰岛β细胞的可能机制。实验结果显示，STZ处理后的模型组与正常组比较，胰岛β细胞培养液中NO含量明显增加，细胞核内NF-кB、iNOS表达增加（P<0.01）；而与模型组比较，给药组细胞培养液中NO含量降低，细胞核内NF-кB、iNOSmRNA表达减弱。因此表明，南瓜多糖保护STZ损伤胰岛β细胞机理可能是通过抑制NF-КBmRNA的过量表达，进而下调iNOSmRNA表达来抑制NO水平，最终减轻细胞损伤程度，提高损伤胰岛β细胞SOD酶活性，最终起到保护胰岛β细胞的作用。通过比较ATPS-PP-1与ATPS-PP-2对NF-κB-iNOS-NO通路干预效果，结果显示在高浓度下（1000μg/mL）ATPS-PP-1的干预效果优于ATPS-PP-2（p<0.05）。
通过比较ATPS-PP-1与ATPS-PP-2两者间活性的差异，结果显示ATPS-PP-1对胰岛β细胞的保护效果优于ATPS-PP-2，根据实验结果及文献报道推测由(1→3)-Glc构成主链的ATPS-PP-1具有较强的活性,此外在满足南瓜多糖活性的最佳相对分子质量范围内，分子量较小的ATPS-PP-1展现出较强的保护效果。
（1）南瓜多糖的提取与分离纯化
本文结合微波和超声辅助提取技术的优点，探讨超声微波辅助萃取仪提取南瓜多糖的最佳工艺条件。通过单因素实验得到南瓜多糖超声微波辅助浸提的最优条件为：料液比1:60，温度70℃，时间30min。在此最佳工艺条件下南瓜粗多糖提取得率为54.7%。对上一步超声微波辅助萃取制得的南瓜多糖粗提液，用双水相作初步的纯化。首先是探究不同系线长度（TLL）的乙醇-硫酸铵双水相体系对南瓜多糖富集纯化的影响，其次是对双水相富集得到的多糖（APTS-PP）用DEAE-纤维素-52阴离子交换树脂作进一步纯化。实验结果表明多糖主要富集于下相，色素等杂质则富集于上相，且TLL=45的乙醇硫酸铵体系对南瓜多糖具有较好的富集效果，下相多糖收率为78.34%，蛋白残留率为14.62%。Sevage法脱除蛋白后多糖得率为63%，蛋白残留率22.22%。由此可知ATPS法相较Sevage法在除蛋白方面具有一定优势。南瓜多糖粗提液经乙醇硫酸铵ATPS处理后的下相，通过DEAE纤维素-52柱层析分离可得到两种多糖组分为中性组分ATPS-PP-1、酸性组分ATPS-PP-2，多糖得率依次为39.1%、53.7%，纯度分别为89.41%、92.68%。
（2）ATPS-P-1、ATPS-PP-2的结构解析
间羟联苯法测定ATPS-PP-1、ATPS-PP-2糖醛酸含量依次为2.96%、10.73%。HLPC-ELSD测定ATPS-PP-1、ATPS-PP-2的分子量分别是7.67KD、8.83KD。高效液相色谱法测定ATPS-PP-1的单糖组成为葡萄糖，含量100%，APTS-PP-2单糖组成有葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，含量依次为8.71%、79.23%、6.57%、5.48%。通过甲基化分析和NMR技术对多糖结构进行解析，结果表明ATPS-PP-1和ATPS-PP-2的构型都为α构型，糖环都为吡喃糖环。ATPS-PP-1的糖链主要是T-Glc，(1→3)-Glc，(1→3,4)-Glc，其中以(1→3)-Glc构成多糖主链；ATPS-PP-2的糖链主要是T-Glc，(1→4)-Glc，(1→6)-Glc，(1→3)-Gal和(1→3,6)-Glc，其主链主要由(1→4)-Glc残基构成。
（3）南瓜多糖各组分对STZ诱导胰岛β细胞损伤的保护作用及机制研究
南瓜多糖的体外降糖实验表明，不同浓度的南瓜多糖对STZ损伤的胰岛β细胞，有一定的保护作用，且这种保护作用呈现一定的剂量依懒性。通过研究不同浓度的STZ对胰岛β细胞活性影响，筛选出最适的STZ损伤造模浓度为3mmol/L。通过以上实验研究发现，STZ与胰岛β细胞共同孵育后，细胞存活率下降，光镜下可见贴壁细胞出现凋亡细胞的特征：细胞皱缩、变圆、脱落，细胞群数量减少。且细胞内SOD酶活性明显下降，脂质过氧化损伤明显增加，MDA浓度升高。南瓜多糖干预损伤组后，能显著提高胰岛β细胞的SOD酶活性，降低MDA浓度。通过对比ATPS-PP-1与ATPS-PP-2对胰岛β细胞的保护效果，结果显示高浓度下（1000μg/mL）ATPS-PP-1在提高细胞存活率、SOD酶活性及降低MDA浓度方面效果优于ATPS-PP-2（P<0.05）。
观察南瓜多糖各组分对STZ损伤大鼠胰岛β细胞NO产生、NF-κB和iNOSmRNA表达的影响，进一步探讨南瓜多糖各组分保护胰岛β细胞的可能机制。实验结果显示，STZ处理后的模型组与正常组比较，胰岛β细胞培养液中NO含量明显增加，细胞核内NF-кB、iNOS表达增加（P<0.01）；而与模型组比较，给药组细胞培养液中NO含量降低，细胞核内NF-кB、iNOSmRNA表达减弱。因此表明，南瓜多糖保护STZ损伤胰岛β细胞机理可能是通过抑制NF-КBmRNA的过量表达，进而下调iNOSmRNA表达来抑制NO水平，最终减轻细胞损伤程度，提高损伤胰岛β细胞SOD酶活性，最终起到保护胰岛β细胞的作用。通过比较ATPS-PP-1与ATPS-PP-2对NF-κB-iNOS-NO通路干预效果，结果显示在高浓度下（1000μg/mL）ATPS-PP-1的干预效果优于ATPS-PP-2（p<0.05）。
通过比较ATPS-PP-1与ATPS-PP-2两者间活性的差异，结果显示ATPS-PP-1对胰岛β细胞的保护效果优于ATPS-PP-2，根据实验结果及文献报道推测由(1→3)-Glc构成主链的ATPS-PP-1具有较强的活性,此外在满足南瓜多糖活性的最佳相对分子质量范围内，分子量较小的ATPS-PP-1展现出较强的保护效果。