研究背景和目的近年来,肝癌的发生率和死亡率一直呈现稳定增长的趋势。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌病理分型中最常见的类型。缺氧微环境是实体肿瘤的重要特征,并能够影响肿瘤细胞的侵袭、转移、上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程和血管形成。EMT参与了机体胚胎发育和肿瘤进展的过程。血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是近年来发现的由肿瘤细胞构成的一种特殊的血液供应模式,不依赖内皮细胞,在管腔中可以观察到红细胞。研究已表明,有VM存在的肿瘤预后差,并且VM可以促进肿瘤的进展过程。HIF-1α是缺氧时关键的调控因子,促进肿瘤细胞更好的适应缺氧,增强自身的存活和肿瘤的发展。LOXL2是铜依赖性单胺氧化酶,能够催化细胞外基质中弹性纤维和胶原纤维的交联。在肿瘤中,LOXL2能促进肿瘤的转移、影响血管的生成,是病人预后的不良因素。最近有研究表明,HIF-1α能促进LOXL2的表达。本实验通过研究在缺氧微环境中LOXL2在HIF-1α影响肿瘤侵袭、迁移,EMT发生和VM形成中的作用,以及与LOXL2发挥功能的有关的分子机制,从而为肝细胞肝癌的临床治疗提供新的思路和药物靶点。研究方法一、研究人肝细胞肝癌组织中HIF-1α与LOXL2之间的相关性。收集天津医科大学肿瘤医院和总医院肝细胞肝癌标本201例。这些病人都经过手术切除治疗,具有完整的随访资料。对肝细胞肝癌病理组织切片进行HIF-1α与LOXL2免疫组织化学染色和CD31/PAS双重染色,观察并分析HIF-1α与LOXL2的表达和患者性别、年龄、肿瘤病理分级、肿瘤大小、肿瘤转移状况、预后以及和VM的相关性,并通过Pearson相关分析分析HIF-1α与LOXL2表达的相关性。二、HIF-1α通过LOXL2影响EMT发生和VM形成的体外研究。1)对体外培养的肝癌细胞应用二氯化钴(Co Cl2)模拟缺氧,转染HIF-1α下调质粒使HIF-1α的表达下调,应用Western Blot、q RT-PCR和免疫荧光观察HIF-1α对LOXL2表达的影响。2)在缺氧的条件下,转染HIF-1α下调质粒和LOXL2上下调质粒,通过侵袭实验和划痕实验检测HIF-1α通过调控LOXL2表达对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响,利用Western Blot和q RT-PCR检测EMT相关指标E-cadherin和vimentin的表达情况。3)利用三维培养模型分析LOXL2在HIF-1α影响肝癌细胞管道形成过程中所起的作用。三、通过Affymetrix HTA2.0基因表达谱芯片分析研究与LOXL2在肿瘤缺氧微环境下发挥作用有关的分子。通过对Hep G2-LOXL2、Hep G2-缺氧、Hep G2-对照三组细胞进行基因表达谱研究,分析与LOXL2在肿瘤缺氧微环境下发挥作用相关的分子。通过PCR对芯片结果进行验证。研究结果一、在肝细胞肝癌中HIF-1α与LOXL2高表达,HIF-1α阳性患者与LOXL2阳性患者预后较差,HIF-1α表达与LOXL2表达以及VM呈正相关。免疫组化结果显示:在201例肝细胞肝癌病例中,HIF-1α阳性病例94例(46.77%),有VM存在的患者中HIF-1α表达明显高于无VM存在患者(χ2=6.270,P=0.012)。通过对肝癌病理分级比较,在Ⅲ、Ⅳ级病人的癌组织中HIF-1α表达比Ⅰ、Ⅱ级病人要高(χ2=4.993,P=0.025)。LOXL2免疫组化结果显示,在201例肝细胞肝癌病例中,LOXL2阳性病例102例(50.75%),有VM存在的患者中LOXL2表达明显多于无VM存在患者(χ2=4.830,P=0.028)。在Ⅲ、Ⅳ级病人的癌组织中LOXL2表达比Ⅰ、Ⅱ级病人要高(χ2=4.750,P=0.029)。KM生存分析结果显示,HIF-1α阴性患者比阳性患者生存时间长(P<0.05),LOXL2阳性患者比阴性患者生存时间短(P<0.05)。HIF-1α与LOXL2的表达在患者性别、年龄、肿瘤大小以及是否发生转移的差异中没有统计学意义(P>0.05)。Pearson相关分析结果显示在肝细胞肝癌中HIF-1α表达与LOXL2表达成正相关(r=0.1990,P=0.004)。二、在肝癌细胞缺氧微环境中,HIF-1α可以调控LOXL2表达影响肝癌细胞侵袭、迁移,EMT发生和VM形成。1、在肝细胞肝癌中,HIF-1α可以调节LOXL2的表达。在缺氧条件下,下调HIF-1α的表达,可以观察到肝癌细胞的侵袭、迁移和管道形成能力下降,EMT相关分子E-cadherin表达增多,vimentin表达减少。2、在缺氧条件下,下调HIF-1α表达,LOXL2的表达减少。将HIF-1α下调质粒和LOXL2上调质粒共转染后,发现肝癌细胞的侵袭、迁移和管道形成能力增强,同时促进了EMT的发生。3、在缺氧时,HIF-1α表达上调,LOXL2表达也随之增加。将LOXL2下调,削弱了肝癌细胞的侵袭、迁移和管道形成能力,抑制了EMT的发生。三、人Affymetrix HTA2.0基因表达谱分析结果1、通过三组细胞的生物学过程的GO分析,发现LOXL2的变化可能引起一些与肿瘤有关的生物学过程的变化。2、在这些有差异表达的基因中,通过Pubmed搜索其他研究者的文章,分析了fold change≥2的基因的功能,挑选了12个与肿瘤有关的基因进行PCR验证。结论1、人肝细胞肝癌中,HIF-1α与LOXL2高表达,HIF-1α与LOXL2的表达和肝细胞肝癌的病理分级相关,与VM相关。HIF-1α和LOXL2阳性患者预后更差。有VM存在的病人比无VM存在的病人预后差。在肝细胞肝癌人体组织标本中,HIF-1α与LOXL2呈正相关关系。2、在人肝癌细胞系Bel7402和Hep G2中模拟缺氧,发现HIF-1α可以调控LOXL2的表达,并且HIF-1α可以通过调控LOXL2表达影响肝癌细胞侵袭、迁移,EMT发生以及VM的形成。3、表达谱芯片分析表明,LOXL2过表达和缺氧后,与肿瘤有关的一些生物学功能可能被激活。PCR验证结果表明,在这12个基因中,HLTF,CENPF,ASPM,NIPBL,SLK,PIK3C2A,SMC2,TAF9B和ATAD2的表达与芯片结果一致,AGL,LRPPRC和ATP5E的表达与芯片的表达不一致。