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肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员之一,主要分布于动物的肌肉组织中,对骨骼肌等生长发育起着负调控作用。与同一家族的GDF-8、IGF等的调节机制不同,MSTN基因的突变或部分缺失,可导致Myostatin的抑制功能完全丧失,从而引起肌肉细胞的增殖和肌纤维的增大。MSTN基因通常由3个外显子和2个内含子组成,可在不同的组织中表达,但丰度有明显的差异,肌肉中表达量最高,而其它组织也有表达。绵羊MSTN基因的编码序列为1128 bp,编码375个氨基酸。许多研究证明,MSTN基因是影响畜禽骨骼肌生长的重要候选基因,已成为动物育种中选择的主要目标性状之一,对筛选和鉴定影响生长速度的相关基因或数量性状座位(QTL),改善肉质,提高瘦肉率,具有重要的理论意义和应用价值。绵羊MSTN基因的克隆和表达研究为MSTN基因打靶和肌肉发育调控机理奠定了基础。本实验以小尾寒羊和杜泊羊的杂交种羊骨骼肌总RNA为模板,反转录合成cDNA,根据已知的绵羊MSTN基因cDNA序列,设计了5条特异性引物,采用巢式PCR,扩增得到MSTN基因。将MSTN与pMD20-T载体连接,得到重组质粒MSTN-pMD20-T。将重组子转化大肠杆菌DH5α,采用蓝白斑法,筛选得到阳性克隆。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切MSTN-pMD20-T和真核表达载体pcDNA3.1后,将目的片段克隆到pcDNA3.1载体中,得到MSTN-pcDNA3.1。将重组子转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆经筛选、PCR、酶切和测序分析。MSTN基因的表达采用脂质体介导法,将重组质粒MSTN-pcDNA3.1转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,转染培养72h后收获细胞。采用PAGE法和分子免疫印迹法,检测了MSTN基因的表达,同时也做了mRNA水平的检测。研究结果表明:(1)克隆得到的MSTN基因全长为1186 bp,其编码序列为1128 bp,编码375个氨基酸,符合预期的结果。(2)与GenBank中报道的羊MSTN基因序列相比较,其同源性为99%,推导相应氨基酸序列的同源性达98%。高度的保守性反映了该基因功能的重要性以及受到了高度的进化限制。(3)在MSTN基因编码序列中,发现在7个不同位点存在单核苷酸突变,引起了5个编码氨基酸的变化。(4)经PAGE检测,电泳凝胶中可见到蛋白表达,表明CHO细胞中有Myostatin蛋白的表达。