灵芝(Ganoderma lucidum)在我国已有上千年的药用历史,近年来灵芝三萜类化合物因被报道具有多用药理活性而引起了国内外学者们的广泛关注,迄今为止已从灵芝中已分离得到了160余种三萜类化合物。但究竟该如何来开发和应用灵芝中的三萜类化合物?它们又究竟有哪些药理活性?它们是通过何种途径来发挥它们的药理作用?这些问题都成了近年来灵芝三萜的研究和应用中亟待解决的问题。因此,本研究选用当今世界上最为先进的萃取技术之一,即超临界 CO2萃取(SFE-CO2)技术萃取灵芝子实体中的三萜成分,再以抗前列腺癌细胞增殖的生物活性为活性跟踪手段对灵芝中的三萜类化合物进行系统的分离纯化,然后再对分离得到的活性成分对抗前列腺癌的作用机制进行研究。整个研究过程将提取和分离纯化工艺的研究与生物活性的研究相结合,为合理地开发和利用灵芝产品提供科学的数据。　　在采用超临界 CO2技术萃取灵芝子实体中的三萜成分的实验中,本论文通过单因素试验和正交试验确定的最佳萃取条件为:子实体粒度10目、夹带剂95％乙醇、压力35 Mpa、温度40℃、时间2.5 h、CO2流量35 g/min、夹带剂体积:子实体重为6:1(mL/g),在此工艺条件下,萃取物的得率为2.42%,总三萜的得率为0.98%,萃取物中三萜的含量为40.5%。由HPLC图谱分析可知,SFE-CO2萃取灵芝子实体三萜的过程中不同的工艺条件下获得的萃取物中灵芝三萜的种类并没有差异,只是在灵芝三萜的含量上有差异。但各个正交试验的萃取物对肿瘤细胞K562的抑制实验表明,SFE-CO2萃取物对K562的抑制作用与萃取物中三萜的含量呈正相关,最优条件下的SFE-CO2萃取物中三萜的含量最高,高达40.5%。在作用浓度为250μg/mL时,其对K562的抑制率也最高,可达71.36%。与传统的醇提法相比,SFE-CO2法中粗提物和总三萜的萃取率均略低,但其粗提物中三萜的含量较高,且HPLC结果显示,SFE-CO2的粗提物中三萜的种类较多。另外,本论文还利用体外抗肿瘤、抗神经细胞损伤和抗氧化模型比较了这两种方法获得的萃取物生物活性的差异。结果显示,在浓度为100μg/mL时,灵芝子实体超临界 CO2萃取物(SFE-CO2E)对肿瘤细胞 LNCaP、K562和 HepG2增殖的抑制率分别为78.37%、87.09%、78.85%,结果均高于灵芝子实体醇提物(EtOHE)的60.65%、82.29%、66.15%;在体外抗神经细胞损伤的模型中,在浓度为200μg/mL时,SFE-CO2E对PC12细胞的修复率为59.29%,优于EtOHE的17.77%;然而在清除羟基自由基、H2O2自由基和DPPH自由基的实验中,在浓度为800μg/mL时, EtOHE对三种自由基的清除率分别为61.90%、67.33%、52.07%,结果均高于SFE-CO2E的29.24%、39.43%、17.05%。由以上结果可见,超临界 CO2萃取法和醇提法在萃取灵芝子实体中的不同生物活性物质方面各有优势。针对中试的试验设备,我们还设计了超临界 CO2萃法萃取灵芝子实体三萜的中试萃取工艺,结果如下:使用夹带剂泵连续的加入夹带剂,灵芝子实体粒度为40目,夹带剂即乙醇的浓度为95%,萃取压力为35 Mpa、萃取温度为40℃、萃取时间为100min、CO2流量为35 g/min、夹带剂泵的行程为15mm。在此条件下SFE-CO2萃取灵芝子实体总三萜的萃取率可达1.66%。　　在灵芝子实体抗前列腺癌活性成分的研究中,我们先用不同的有机溶剂,按极性从小到大对灵芝子实体的SFE-CO2E进行分部,然后再以抑制前列腺癌细胞LNCaP增殖的活性为指导,对活性部位用硅胶柱层析、凝胶柱层析法等方法进行分离纯化,最终得到10个化合物,其中乙酸乙酯萃取部分共分离得到4个化合物(化合物1-4),氯仿萃取部分共分离得到了5个化合物(化合物1,2,8,9,10),石油醚萃取部分共分离得到了4个化合物(化合物1,5,6,7)。在这些化合物中只有化合物2有明显的抑制LNCaP增殖的活性,在作用浓度为100μg/mL时,其对LNCaP细胞增殖的抑制率可达50%以上。运用现代的光谱技术(ESIMS、1D NMR、2D NMR等)对获得的化合物的结构进行鉴定,确定化合物1为麦角甾醇和星鱼甾醇的混合物,化合物2为灵芝酮三醇,化合物3为灵芝醇 B,化合物5为 ergosta-7,22-diene-3β-yl pentadecanoate,化合物8为ergosta-7,22-diene-2β,3α,9α-triol,化合物9为灵芝醇 A。抗前列腺癌的活性跟踪实验结果表明,灵芝子实体SFE-CO2E及其分部的各个部分都对LNCaP细胞的增殖具有抑制作用,且随着浓度升高其抑制作用也增强。灵芝子实体 SFE-CO2萃取物对LNCaP细胞增殖的抑制作用最强,在作用浓度为100μg/mL时,其对LNCaP细胞增殖的抑制率可达71.76%。各分部部分对LNCaP细胞增殖的抑制作用由强到弱依次为乙酸乙酯部分>氯仿部分>石油醚部分>正丁醇部分。乙酸乙酯部分、氯仿部分和石油醚部分分离纯化所得的各个组份的抗前列腺癌活性跟踪实验结果显示多个组份都具有明显的抗前列腺癌活性。　　在灵芝子实体活性成分的研究过程中我们发现,许多粗分离组分都有很好的抗前列腺癌细胞增殖的生物活性,然而分离得到的化合物的活性却不理想,因此我们对灵芝子实体 SFE-CO2E和四种灵芝三萜类的化合物抗前列腺癌作用的机理都进行了初步的研究。我们运用四唑盐(MTT)比色法、酶联免疫(ELISA)法和蛋白质印迹法(Western bloting)研究了灵芝子实体的SFE-CO2E、灵芝醇B、灵芝酮三醇、灵芝酸S和灵芝酸R对雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP细胞的增殖、分泌前列腺特异性抗原(PSA)和表达雄激素受体(AR)的抑制作用。另外我们还建立了HPLC法研究活性物质对5α-还原酶的抑制作用的体外模型。建立的HPLC法检测5α-还原酶活性的体外实验模型如下:色谱分离条件为YMC-Pack ODS-AQ色谱柱(5μm,250 mm×4.6 mm),流动相:甲醇/水=75/25,流速为1.0 mL/min,进样量为20μL;柱温为常温;检测波长为242 nm,睾酮(T)的出峰时间为8.83 min。总体积为200μL的5α-还原酶催化反应体系:待测样品10μL,1 mM的T10μL,0.625 mg/mL大鼠肝微粒体160 mL,6 mM的NADPH20μL,37℃反应80 min。反应完成后加入400μL甲醇终止反应,15294 g离心30 min后取上清用0.22μm的膜过滤后上HPLC进行分析。HPLC法检测5α-还原酶活性的实验结果显示灵芝子实体SFE-CO2E、灵芝酮三醇、灵芝醇B、灵芝酸S和灵芝酸R都对5α-还原酶具有明显的抑制作用,四种灵芝三萜类化合物对其抑制作用由强到弱依次为灵芝酸 R>灵芝酸 S>灵芝醇B>灵芝酮三醇。MTT法检测活性物质对LNCaP细胞的增殖的抑制作用的结果显示,在有或没有雄激素睾酮(T)和双氢睾酮(DHT)存在的条件下,灵芝子实体 SFE-CO2萃取物、灵芝酮三醇、灵芝酸 S和灵芝酸R都对LNCaP细胞的增殖有抑制作用且呈现浓度依赖性,但灵芝醇B只在T和DHT存在的条件下才对LNCaP细胞的增殖有抑制作用且呈现浓度依赖性。ELISA法检测活性物质对 LNCaP细胞分泌PSA的抑制作用的结果显示,灵芝子实体SFE-CO2萃取物、灵芝酮三醇、灵芝醇B、灵芝酸S和灵芝酸R都对LNCaP细胞分泌PSA具有明显的抑制作用,并且在T或DHT存在的条件下,它们对LNCaP细胞分泌PSA的抑制作用比没有T或DHT存在时更强。Western bloting的实验结果显示,灵芝子实体 SFE-CO2萃取物、灵芝酮三醇、灵芝醇B、灵芝酸S和灵芝酸R都能在不同的浓度下对LNCaP细胞表达AR起到抑制作用。综上所述可知,灵芝子实体 SFE-CO2萃取物、灵芝酮三醇、灵芝酸S和灵芝酸R对前列腺癌的抑制作用既与其细胞毒性有关也与其对雄激素的抑制作用有关,而灵芝醇 B对前列腺癌没有细胞毒作用但却能通过抑制雄激素活性和抑制AR的表达来抑制前列腺癌。