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目的:探讨间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对幼龄鼠1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)的防治作用及可能的作用机制,为MSCs预防T1DM提供理论与实践依据。方法:小鼠骨实质MSCs的分离提取与鉴定。分离7日龄乳鼠长骨,经Ⅱ型胶原酶消化后移入培养瓶中贴壁培养MSCs,倒置显微镜观察P0代至P3代MSCs细胞形态;流式细胞术(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测P3代MSCs细胞表型;诱导P3代MSCs向成脂细胞和成骨细胞分化;油红O染色检测MSCs成脂分化能力;碱性磷酸酶染色检测MSCs成骨分化能力;实时定量逆转录-聚合酶链反应(Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)检测成脂关键转录因子C/EBP-α和PPAR/γ及成骨关键转录因子RUNX2和osteocalcin的表达水平。幼龄鼠T1DM模型的建立。分别设定3周龄正常小鼠对照组(NC组)、T1DM对照组(DM组)、MSCs早期预防组(P1组)、MSCs晚期预防组(P7组)和MSCs治疗组(C组),除NC组外,各组小鼠均给予连续5天腹腔小剂量(50 mg/kg/d体重)注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),于STZ注射第1天和第7天经尾静脉输注MSCs(5×10~5个/只)分别建立P1预防组和P7预防组,在STZ注射的第15天输注MSCs(5×10~5个/只)建立治疗C组;监测各组小鼠一般生理状态的改变,包括血糖、体重、皮肤、毛发及生存状态;苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosinstaining,HE)染色、免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)染色及Masson染色检测胰岛组织和肾脏等病理学改变,q RT-PCR检测肾脏纤维化的改变。MSCs对幼龄鼠T1DM的早期防治作用与可能分子机制探究。FACS检测脾脏Th1(Type 1 helper T)淋巴细胞亚群变化;q RT-PCR检测脾脏炎性因子表达水平;血清酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测血清炎症因子表达水平。进一步结合实验室前期MSCs外泌体mi RNA测序结果,筛选获得mi R-148a-3p,经生物信息学预测mi R-148a-3p与免疫调控相关的靶基因为IFN-γ和Fasl。进一步输注MSCs至受体小鼠体内,q RT-PCR检测血清中mi R-148a-3p的表达是否发生改变,体外荧光素酶活性报告系统(Luciferase Reporter Assay system)验证mi R-148a-3p的靶基因是否为IFN-γ和Fasl。结果:1、小鼠长骨骨实质提取的MSCs于倒置显微镜下呈长梭形旋涡状排列,P3代MSCs经流式细胞术检测细胞表型,结果显示,高表达干细胞标志物CD29、CD90、Sca-1;不表达造血标记物CD34、CD45及内皮细胞标记物CD31、单核细胞标记物CD11b;经油红O染色显示其可向成脂肪细胞分化形成大量脂滴,经碱性磷酸酶检测可向成骨细胞分化形成大量骨结节,结合q RT-PCR检测其分化效果显著,高表达成脂关键转录因子C/EBP-α和PPAR-γ和成骨关键转录因子Runx2和osteocalcin。2、成功建立3周龄C57BL/6小鼠1型糖尿病模型。连续5天经腹腔注射50 mg/kg剂量的STZ,小鼠表现为血糖升高(连续三天血糖均高于16.7mmol/L),体重增长缓慢。胰岛组织病理切片可见炎性浸润,胰岛β细胞数目明显减少,肾脏纤维化程度增加,符合T1DM疾病的一般发展规律(建模成功率高达95%)。经小鼠尾静脉输注骨实质来源的MSCs进行预防或治疗,结果表明,MSCs预防组和治疗组均呈现显著的T1DM病程进展改善现象,其中早期预防P1组效果最优:小鼠体重增长趋势良好,血糖上升趋势缓解,胰岛β细胞损伤破坏程度降低,且T1DM引发的肾脏纤维化程度亦降低。3、FACS检测MSCs预防组的Th1淋巴细胞亚群比例较T1DM组显著降低,q RT-PCR检测结果显示,MSCs输注后脾脏炎症因子TNF-α及IFN-γ表达下调;血清ELISA检测结果显示,MSCs输注后血清炎症因子TNF-α及IFN-γ的表达显著下调。MSCs输注后可检测到小鼠血清外泌体来源mi R-148a-3p的表达显著升高,经荧光素酶报告系统检测及体外验证结果表明,mi R-148a-3p可下调其靶基因m Fsal和m IFN-γ的表达。结论:早期输注MSCs可显著改善幼龄小鼠T1DM鼠的血糖水平,减少胰岛损伤,缓解T1DM引发的肾脏病变进程;MSCs可通过外泌体的mi R-148a-3p靶向下调m Fsal和m IFN-γ表达,减轻T1DM模型小鼠的炎症反应进程,缓解T1DM病程发展。因此,早期MSCs预防性输注对防治T1DM具有显著的疗效。