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2,4-二氯酚(2,4-dichlorophenol,2,4-DCP)作为氯酚类化合物中最丰富的一员,被广泛应用于合成除草剂,杀虫剂以及医药中间体。由于其应用广、难降解、易富集,可通过直接暴露或食物链进入机体,对生物体的健康造成很大危害,因此包括中国、美国在内的很多国家已将其列入了优先控制污染物名单。目前,很多研究都关注的是如何利用物理化学和生物的方法去降解环境中的2,4-DCP,关于其毒性效应及机理的研究还非常匮乏,而细胞死亡则是最常见,也是最严重的一种细胞毒性效应。基于此,本研究以正常组织来源的两株细胞系人肝脏细胞(Human liver7702cells, HL7702)和小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts, MEFs)为模型,探讨2,4-DCP诱导细胞死亡的方式及其机理,以期为氯酚类化合物提供更加充分的毒理学资料,为其中毒机理和毒性预警提供参考。研究结果显示：1.2,4-DCP(0.50,0.75和1.00mM)暴露24h后可以明显抑制HL7702和MEFs细胞的生长,显著降低细胞活力,使细胞发生皱缩、变圆、胞浆空泡化等形态学改变。同浓度同样的暴露时间,HL7702细胞比MEFs细胞更加耐受2,4-DCP暴露,这可能是由两方面的原因导致的：一是因为HL7702是解毒器官肝脏来源的细胞而MEFs则是胚胎来源的细胞；二是因为MEFs细胞本身就对外源毒物刺激更加敏感。2.2,4-DCP暴露后导致HL7702和MEFs细胞发生凋亡、坏死和自噬性细胞死亡。本研究首先利用Hochest33258染色从形态学上定性观察到了细胞凋亡的发生(细胞核固缩,凋亡小体的形成),然后用流式细胞术定量分析了细胞发生凋亡的比率。线粒体膜电位的降低及凋亡相关基因Bax/Bcl-2比率的升高说明2,4-DCP诱发了线粒体途径的凋亡。Caspase-3活性的升高表明2,4-DCP诱导的细胞凋亡可能是caspase依赖的。PI/Hoechst33342双染法分析发现2,4-DCP高浓度(1.00mM)、长时间(48h)暴露在诱导细胞发生凋亡的同时也诱发了明显的细胞坏死。此外,透射电镜观察到了明显的自噬体,western blotting检测发现自噬标志性蛋白LC3显著地发生了I型向II型的转化(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率增加),表明2,4-DCP暴露也可以诱导细胞发生自噬性细胞死亡。3.2,4-DCP暴露诱导了活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的爆发,导致细胞发生氧化应激。HMOX1(Heme oxygenase-1)和Nrf2(Nuclear factor-E2-relatedfactor2) mRNA表达的升高以及细胞核内Nrf2蛋白表达的升高,表明HMOX1/Nrf2信号通路的激活参与了2,4-DCP诱导的氧化应答反应。持续性的氧化应激可能是2,4-DCP诱导细胞死亡的一个重要原因。4.转录组水平研究结果表明,2,4-DCP主要影响了细胞的固醇／胆固醇合成、内质网应激反应以及固醇/胆固醇代谢过程等与内质网功能密切相关的生物学途径,提示2,4-DCP主要通过影响内质网的功能体现其毒性作用。内质网应激相关基因Bip和CHOP在mRNA水平和蛋白水平的激活表明2,4-DCP可以诱导内质网应激的发生。进一步分析内质网应激发生的三个分支(IRE1α、ATF6、eIF2α)的激活情况。结果表明,2,4-DCP可在mRNA水平和蛋白水平上激活HL7702和MEFs细胞内质网应激相关基因IRE1α和ATF6的表达。诱导Xbp1基因的mRNA以剂量依赖的方式发生选择性剪切,在2,4-DCP (1.0mM)暴露的早期阶段(1h)就可以显著诱导eIF2α发生磷酸化,而随着暴露时间的延长eIF2α的磷酸化水平则明显有所恢复。这些结果表明,2,4-DCP暴露可激活IRE1α、ATF6、eIF2α三条未折叠蛋白反应,诱发内质网应激。5.内质网应激保护剂TUDCA (Sodium tauroursodeoxycholate,1.0mM)预处理MEFs细胞后发现2,4-DCP (0.75mM)诱导的细胞凋亡明显缓解。eIF2α去磷酸化抑制剂Sal (Sa1003,15.0μM)与2,4-DCP的共处理也明显削弱了2,4-DCP诱导的细胞凋亡。这些结果表明,eIF2α的去磷酸化介导了2,4-DCP诱导的内质网应激途径的细胞凋亡。因此,内质网应激是2,4-DCP诱导细胞死亡的另一个重要原因。6.利用甲基化DNA免疫共沉淀测序法(Methylated DNA immunoprecipitation sequencing, MeDIP-seq)在全基因组水平上分析2,4-DCP对HL7702细胞DNA甲基化的影响。2,4-DCP (0.50mM)暴露24h后干扰了DNA甲基化动态平衡,发现有2322个基因甲基化水平与对照相比存在显著差异。其中有711个基因甲基化水平上调,1611基因甲基化水平下调。与内质网死亡途径相关基因Bip和DAPK1存在甲基化水平变化。进一步用亚硫酸盐修饰测序法分析了这两个基因启动区甲基化受2,4-DCP暴露的影响情况,发现该区域总DNA甲基化水平与其mRNA表达没有显著的相关性,而一些特异CpG位点的甲基化水平与其mRNA的表达呈负相关,这表明2,4-DCP暴露后,这些位点的甲基化水平的变化可能调控了其基因的表达。此外,DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA表达也发生了明显的上调。这些结果表明2,4-DCP诱导的表观遗传毒性(DNA甲基化异常)可能是其诱导细胞死亡的又一个重要原因。综上所述,本研究表明,2,4-DCP可明显降低细胞活力；诱导细胞发生皱缩、变圆、胞浆空泡化等形态学变化；诱导氧化应激和线粒体膜电位崩解；诱发内质网应激；干扰DNA甲基化平衡；最终诱导细胞发生凋亡、坏死和自噬三种方式的死亡。此外,eIF2α的去磷酸化介导了2,4-DCP诱导的内质网应激途径的凋亡。