到目前为止,脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）仍然是神经科学研究中的难点,它是全球致残的主要原因之一。前期有临床试验证实运动皮层兴奋性增高与脊髓损伤患者的功能预后明显相关。然而,运动皮层的何种细胞类型导致了后期的功能恢复以及恢复的神经机制尚不清楚。本研究我们使用光遗传学技术靶向激活初级运动皮层（M1区）中的谷氨酸能神经元,并研究激活初级运动皮层中的谷氨酸神经元是否能促进大鼠脊髓损伤后的功能恢复及其涉及到的初步神经机制。结果表明,运动皮层中谷氨酸能神经元的靶向激活可以显着改善大鼠的运动功能评分。并且能有效缩短运动诱发电位的潜伏期和提高运动电位振幅。此外,在损伤处的HE（Hematoxylin-eosin,HE）染色和神经纤维（Nerve Filament,NF）染色显示精确激活初级运动皮层能有效促进脊髓损伤处的组织恢复和神经丝（GAP-43、NF）的生长,并且损伤处的一些生长相关蛋白（BDNF、NGF）含量有所增加。这些结果表明,初级运动皮层中谷氨酸神经元的选择性激活可以促进脊髓损伤后的功能恢复,并且可能对理解刺激运动皮层提高运动功能恢复的神经细胞机制具有一定的意义。目的:研究光遗传学激活脊髓损伤大鼠的M1区谷氨酸能神经元对脊髓损伤大鼠的运动功能恢复的影响,并探究其机制。方法:1.随机将90只SD大鼠,雌性（由于雌性大鼠相比于雄性大鼠更方便后期脊髓损伤后的人工排尿和护理,故选择雌鼠）,分为4组:光刺激组（SCI+Ch R2）、假刺激组（SCI+m Cherry）、单纯脊髓损伤组（SCI）和假手术组（Sham）。我们采用的是钳夹法来制备大鼠的不完全脊髓损伤模型,并且在建模后的第一天,通过检测脊髓损伤大鼠的运动诱发电位（Motor Evoked Potential,MEP）（观察其潜伏期和振幅）的波形来确定建模是否成功（如果造模后第一天的运动诱发电位的波幅几乎为一条直线,则表示造模成功）。单纯脊髓损伤组（SCI）仅将脊髓夹闭,假手术组（Sham）仅仅切开对应节段的皮肤并用咬骨钳咬开椎板,不作任何干预;其中假刺激组（SCI+m Cherry）注射病毒为“AAVCa MKⅡα-m Cherry”,该病毒包含的Ca MKⅡα基因启动子序列能够准确的表达在谷氨酸能神经元内,但由于它不含光通道蛋白基因,所以在473nm的蓝光刺激时不可以把M1区的受该病毒成功转染的谷氨酸能神经元激活。相反,光刺激组（SCI+Ch R2）注射病毒为“AAV-Ca MKⅡα-Ch R2-m Cherry”,因为其包含了Ca MKⅡα基因启动子序列和光通道蛋白基因,所以在光刺激后可以精确地感染谷氨酸能的神经元并被相应的蓝光激活。待到病毒注射成功后,病毒在注射的M1区表达后（约注射病毒后3周作用）,采用免疫荧光法对注射病毒的大脑区域进行切片DAPI染色和c-Fos染色,并且用全玻片扫描进行观察。由此来确认病毒注射位点和注射量是否足以引起相应的反应。2.病毒表达后进行造模操作,剥开T10的椎板,使用50g动脉瘤夹压迫T10脊髓60s,在此期间伴有尾摇和后肢反射,提示脊髓损伤模型成功。此外,为检测造模是否成功,建立脊髓损伤模型后的第一天,对受伤的大鼠进行运动诱发电位（Motor Evoked Potential,MEP）测试,以查看振幅和潜伏期是否与截瘫的波形特征一致。3.光刺激组和假刺激组的大鼠于造模成功后第3—14天进行473nm蓝光刺激,每日2次,共刺激2周。单纯脊髓损伤组做常规的人工排尿工作,假手术组在笼中喂养,此外不做任何操作,直到实验结束。4.光刺激完成（脊髓损伤造模后2周）后,最后一次光刺激后90分钟内（此时注射的病毒经光刺激后大量表达）行心脏灌注术,并且将脊髓剥离出来,将损伤处的前后1cm处切下冷冻于-80℃冰箱中,使用WB检测各组大鼠脊髓损伤处的生长相关蛋白（43-KDa Growth-associated Protein,GAP-43）、脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF）和神经生长因子（Nerve Grouth Factor,NGF）的蛋白表达情况。5.采用BBB（Basso,Beattie,and Bresnahan,BBB）评分和斜坡实验在脊髓损伤后1—6周时每周评价脊髓损伤大鼠的运动功能。6.在脊髓损伤后第6周时,灌注取每组大鼠的脊髓组织进行HE染色和神经纤维丝（Nerve Filament,NF）的免疫荧光染色,观察受伤部位的脊髓修复情况。另外,在每组大鼠中再次测量运动诱发的电位,以观察振幅和潜伏期的变化。结果:1.M1区谷氨酸能神经元的激活大鼠注射腺相关病毒3周后,通过DAPI染色,显示该病毒在双侧M1区有明显且稳定的表达,并且通过对大脑的c-Fos染色也显示M1区的谷氨酸能神经元被激活。我们应用473nm蓝光对大鼠大脑M1区刺激,检测刺激时细胞的放电情况,发现大鼠M1区受刺激的细胞的放电明显增加,并且对刺激大鼠进行摄像观察,发现大鼠在光刺激时后肢出现不自主运动,光停止时不自主运动也停止。这些结果证明我们注射病毒的位点准确而且该病毒也能在光刺激下激活M1区的兴奋性神经元。这为我们接下来的实验奠定了良好的基础。2.光刺激激活M1谷氨酸能神经元促进大鼠脊髓损伤术后运动功能恢复大鼠脊髓损伤后1-6周,我们通过BBB评分和斜坡试验来测试脊髓损伤大鼠后肢每周的功能变化,发现随着时间的递增,各组脊髓受损大鼠的行为学BBB评分和斜板稳定坡度都逐渐增加,但是光刺激组的大鼠表现更好。3.光刺激激活脊髓损伤后大鼠M1区谷氨酸能神经元可以部分促通下行传导束所有接受脊髓损伤造模的大鼠,在造模后第一天进行运动诱发电位的检测,只有波形为水平线（波幅为0证明造模成功）的大鼠才可以被用作后续实验。在运用473nm波长的蓝光对大鼠大脑M1区进行靶向激活时,通过对刺激大鼠进行摄像观察,发现大鼠在光刺激时后肢会出现不自主运动。在脊髓损伤后第6周,我们再次对各组大鼠的运动诱发电位进行逐一地检测,发现各组大鼠的运动诱发电位的波幅均有所增加,但光刺激组的潜伏期有明显的缩短,而且该组大鼠的波幅也出现较为明显的增加。表明光刺激激活M1区谷氨酸能神经元后,大脑M1区的神经冲动反复传至脊髓损伤的位置,通过反复地促通下行传导束,从而引发脊髓损伤大鼠后肢被动的不自主运动,最终使得脊髓损伤大鼠的运动功能得以提高。4.光刺激激活脊髓损伤大鼠M1区谷氨酸能神经元能够促进损伤处的组织修复为了探究M1重复刺激后大鼠功能恢复明显改善的原因,在第6周时,我们采用HE染色,观察损伤的三组脊髓损伤术后组织学变化。发现光刺激组的大鼠损伤处的组织更加边界更加清晰,空洞面积更小。5.光刺激激活脊髓损伤大鼠M1区谷氨酸能神经元增加了损伤处的神经营养蛋白的表达我们采用WB检测脊髓损伤部位神经营养因子（BDNF、NGF）的表达。光刺激组的这两项指标都有所上调。这些结果表明M1区的精准激活可以促使损伤处神经营养因子的表达,这些神经营养因子作用于损伤处的组织,并且使得损伤处的神经纤维部分再生和修复。6.光刺激激活脊髓损伤大鼠M1区谷氨酸能神经元促使脊髓损伤大鼠损伤处的神经丝的再生我们检测了神经生长相关分子（GAP-43）的表达水平。结果显示,在M1区反复刺激脊髓损伤的大鼠中GAP-43的表达水平有所增加。此外,我们用免疫荧光染色在试验终点（即第6周）各组大鼠损伤处的神经纤维（NF）的水平,结果显示光刺激组大鼠脊髓损伤处神经纤维（NF）的平均荧光强度略高于其他损伤组。我们认为,大鼠脊髓损伤后,通过对大脑M1区的谷氨酸能神经元的激活可以促进脊髓损伤处的神经丝再生,从而促进损伤大鼠的运动功能的恢复。结论:上述结果表明,脊髓损伤后激活大脑M1区的谷氨酸能神经元可以促进其运动功能的恢复,其原因可能与该刺激增加了损伤处神经营养因子的表达有关。