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真核生物RNA干扰过程可分为三步：首先一个长的双链RNA(在细胞内表达或外源导入),在Drosha和Dicer两种RNase III酶作用下,加工成小双链RNA；第二步双链解旋,其中一条链装载到RNA-induced silencing complex (RISC)蛋白复合中；第三步,RISC复合物介导切割与siRNA互补区域的目的mRNA分子,从而阻止靶基因的表达。此过程中RNase III起重要作用,主要Drosha和Dicer两种RNaseⅢ家族的酶参与siRNA剪切成熟过程。2002年,Yang D等人发现大肠杆菌的RNase III能将双链的RNA剪切成有干扰作用的siRNA混合物[1],从而介导RNA干扰。因此推测细菌RNase Ⅲ可能在原核生物处理外来RNA过程中起作用。本研究以大肠杆菌RNase III在原核生物中的作用为切入点,采用细菌双杂交的方式从构建的细菌cDNA文库中钓取与大肠杆菌RNaseⅢ有相互作用的蛋白,并研究这些蛋白与RNase III在原核生物处理外来RNA过程中所起的作用,以帮助确认原核生物中是否存在类似真核生物的RNA干扰过程。采用stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒构建大肠杆菌的cDNA文库。用Trizol试剂提取大肠杆菌的总RNA,在E.coli poly(A) Polymerase作用下给mRNA特异性地加上poly(A)尾,分离纯化mRNA,利用mRNA作为模板反转录合成双链DNA。经pfx酶补平双链末端,在两端加上EcoRI接头,Xho Ⅰ酶切消化产生粘性末端。用CHROMA SPIN-400column分级分离纯化cDNA片段,与pTRG XR载体连接后,电击转入XL1-BLUE MRF’菌电转感受态中。得到原始文库,经计算文库的容量达到3×106个克隆。用PCR方法测得文库的重组率为100%,插入片段的平均长度基本位于300bp以上,测定放大文库的滴度为：3.15×1010pfu/mL。说明构建的大肠杆菌cDNA文库质量比较高,适合用于筛选目的基因克隆。文库的筛选,将pBT-RNaseⅢ质粒和pTRG-cDNA文库质粒电击共转入XL1-BLUE MRF’筛选菌中。在筛选平板上两次筛选后得到379个克隆,挑取这379个克隆做菌落PCR,对PCR产物按大小分组后再经MSP I酶切,剔除酶切片段一致的克隆,最终得到169个克隆。其中有35个克隆重复次数达到三次以上,全部测序后在NCBI中做BLAST比对,发现大部分的克隆为16SrRNA和23SrRNA,也发现一些与糖代谢有关的酶,如吡哆醛激酶、转酮醇酶、异柠檬酸脱氢酶等,或许细菌RNase Ⅲ酶也参与细菌的糖代谢。本次主要研究16SrRNA克隆,在体外经GST-PULL DOWN实验证实Nase Ⅲ和16S rRNA片段在体外存在相互作用。而将RNase111分为C端结构域和N端结构域后,发现分段后的RNase Ⅲ与16SrRNA片段的相互作用远弱于与完整RNase Ⅲ的相互作用,说明RNaseⅢ的两个结构域对RNaseⅢ与16S rRNA片段相互作用都是必需的。通过半定量PCR验证发现16S rRNA与RNase III相互作用后能增强RNase III的剪切活