论文部分内容阅读
目的:P450单加氧酶在自然界中分布广泛,参着生物体生命活动的多种进程,包括一些类固醇物质的生物合成、药物和脂肪酸的代谢等,细胞色素P450酶系因其种类和催化反应类型的多样性以及底物的广谱性被称为万能催化剂。而单加氧酶CYP119在高达85℃时仍具有酶活性,是世界上第一个被克隆和X-ray晶体衍射确定结构的耐热酶,尽管其内源性底物还不是很清楚,但已经研究证实能催化苯乙烯的环氧化和月桂酸的羟基化。本实验主要研究CYP 119的克隆、表达和纯化,进一步探索其催化苯乙烯环氧化反应的性能。方法:培养硫矿硫叶菌提取其总DNA,根据已知的CYP119序列设计引物克降编码CYP119 酶的基因,将添加了酶切位点的CYP119 DNA’与PET30a 用EcoRⅠ和Xho Ⅰ双酶切后连接在一起构造出一个新的质粒PET30a-CYP119,将其转入大肠杆菌BL21中,在IPTG的诱导下表达CYP119酶。将得到的初酶液经-70℃冷冻、超声破胞和加热处理纯化,再用Ni-NTA柱进一步纯化,SDS-PAGE检测蛋白纯度。最后用得到的酶液催化苯乙烯的环氧化反应,并与CPO的催化反应进行对比,高效液相色谱分析反应产物。结果:经过与NCBI上CYP119序列的Blast比对,有96%的相似度。通过将构建好的质粒先转入大肠杆菌DH10B中,进行菌落PCR筛选阳性菌,从阳性中再提取质粒转入BL21中,挑选出阳性菌扩大培养进行诱导。SDS-PAGE结果看出,经过纯化后杂蛋白逐渐减少,过柱后得到约45kD的单一条带。经HPLC分析,苯乙烯环氧化反应有少量环氧苯乙烷生成,主要以S构型产物为主,CPO催化环氧化反应也是以S构型产物为主。结论:从 ATCC 购买的Sulfolobus solfotaricus(Strain#35091)的 DNA 中可以克隆出CYP119的基因。影响诱导表达蛋白的因素主要是IPTG的浓度、加入IPTG时的菌液浓度和诱导的时间,待BL21在2×YT培养基中生长至菌液浓度OD600为0.6-0.8至时加入IPTG浓度为5mM,诱导培养12h效果最什。CPY119 与CPO催化苯乙烯环氧化反应均具有立体选择性,主要以S构型的产物为主,从反应条件上来说,CYP119作为催化剂更具有优越性。